II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Nguyên liệu
5. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng trong các dịch trích từ thực vật
thực vật
5.1. Hĩa chất
Thuốc thử Folin-Ciocalteau (pha lỗng 10 lần) Natri carbonate(Na2CO3) 7,5%
Chất chuẩn: gallic acid nồng độ 35 µg/L.
5.2. Cách tiến hành
Lấy 1 mL dịch trích sau ly tâm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2,5ml tác nhân Folin-Ciocalteau. Sau 4 phút, thêm vào 2ml dung dịch Natri Carbonate 7,5%. Lắc đều rồi để yên cho hỗn hợp phản ứng trong 60 phút. Sau thời gian này, lấy mẫu đo quang phổ ở bước sĩng 760nm. Nếu kết quả vượt chuẩn thì pha lỗng mẫu trong nước đến nồng độ thích hợp.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: dung dịch chuẩn là acid gallic cĩ các nồng độ trong dãy từ 0-35 µg/L.
Chuẩn bị mẫu trắng: mẫu trắng chứa 1 ml nước cất + 2,5ml thuốc thử Foiln + 2ml Na2CO3 7,5%.
Chuẩn bị mẫu đối chứng(control): mẫu đối chứng được chuẩn bị tương tự như mẫu thí nghiệm nhưng thay 1ml dịch trích bằng 1ml dung mơi. Chú ý rằng, nếu dịch trích pha lỗng trong nước bao nhiêu lần thì dung mơi cũng phải pha lỗng trong nước bấy nhiêu lần, nghĩa là hệ số pha lỗng của dung mơi phải bằng hệ số pha lỗng của dịch trích.
Tất cả các mẫu đều được đo ở bước sĩng 760nm.
Bảng 4: Phương pháp lấy mẫu đo quang phổ ở bước sĩng λ =760 nm
STT Mẫu
trắng 1 2 3 4 5 6 Mẫu1 Mẫu2 Mẫuđối
chứng Acid
gallic(ml)
Vdungmơi(ml) 1 VH2O(ml) 1 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 Folin(ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Na2CO3(ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 OD(760 nm) 5.3. Cơng thức tính
Từ kết quả đo dung dịch chuẩn, dựng đường chuẩn acid gallic y= f(x) với y là mật độ quang, x là nồng độ chất chuẩn (µg acid gallic /L). Tính độ lệch chuẩn R2 của đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ acid gallic trong mẫu đo quang học M (µg acid gallic /L). Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu được tính như sau: ) 100 .( 100 . 1000 . . W m V f M PP − =
PP: hàm lượng polyphenol tổng trong nguyên liệu (µg acid gallic/g chất khơ)
M: hàm lượng polyphenol trong mẫu đo quang học (µg acid gallic /L) f: hệ số pha lỗng
V: thể tích dung mơi dùng trích ly polyphenol (ml) m: khối lượng mẫu đem trích ly (g)
W: độ ẩm mẫu (%).
6. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly của dịch trích cĩ hoạt tính chống oxi hĩa cao nhất
Cốđđịnh tất cả các yếu tố, ngoại trừ yếu tố muốn khả sát và tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của yếu tố này đến hoạt tính chống oxi hĩa trong dịch trích. Từ kết quả thu được, tiến hành phân tích phương sai(ANOVA) để đánh giá sự khác biệt giữa các giá trị thu được. Sau đĩ, tiến hành khảo sát các yếu tố cịn lại như trên. Dùng phần mềm Excel để tiến hành tối ưu hĩa quá trình trích ly chất chống oxi hĩa theo phương pháp đường dốc nhất.