V. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHỐNG OXI CỦA CÁC DỊCH TRÍCH TỪ THỰC VẬT
1.Phương pháp xác định trực tiếp hoạt tính chống oxi hĩa
- Phương pháp TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity): Xác định hoạt tính chống oxi hĩa so với khả năng chống oxi hĩa của Trolox.
- Phương pháp DPPH(Scavenging ability towards DPPH radicals): Khả năng khử gốc tự do DPPH
- Phương pháp ORAC(oxygen radical absorbance capacity): xác định khả hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động.
- Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): Khả năng chống oxi hĩa bằng cách bẫy các gốc tự do.
1.1. Phương pháp TEAC
Cation ABTS+[2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS)] là một gốc tự do bền. Đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp thu 734 nm. Khi cho chất chống oxi hĩa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxi hĩa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sĩng 734nm để xác định hoạt tính của chất chống oxi hĩa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox[6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman- 2-carboxylic acid]. Trong mơi trường kali persulfate, gốc ABTS+ cĩ thể bền 2 ngày ở nhiệt độ phịng trong tối.
1.2. Phương pháp DPPH
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, cĩ màu tía và cĩ độ hấp thu cực đại ở bước sĩng 517 nm. Khi cĩ mặt chất chống oxi hĩa, nĩ sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine(DPPH-H), cĩ màu vàng. Đo độ giảm độ hấp thu ở bước sĩng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hĩa.
Hoạt tính sàng lọc gốc tự do được tính theo phương trình sau: Hoạt tính khử gốc tự do DPPH(%) = 100 ) 30 ( ) 30 ( ) 30 ( ) 0 ( x A A A A phút control phút blank phút sample phút control − − ≈ 1 100 ) 30 ( ) 30 ( ) 30 ( x A A A phút control phút blank phút sample − −
Acontrol(0 phút) = độ hấp thu của mẫu đối chứng ngay sau khi pha chế. Acontrol(30 phút) = độ hấp thu của mẫu đối chứng sau 30 phút ủ.
Asample(30 phút) = độ hấp thu của mẫu thí nghiệm sau 30 phút ủ. Ablank(30 phút) = độ hấp thu của mẫu trắng sau 30 phút ủ.
Lượng mẫu cần thiết để phản ứng với một nửa lượng DPPH(hay độ hấp thu 50%) được gọi là lượng tương đối Trolox phản ứng. Khi đĩ, hoạt tính chống oxi
hĩa của mẫu cĩ thể diễn tả bằng thuật ngữ là số micromole bằng Trolox/100g mẫu hay đơn vị Trolox/100g hay TE/100g. (TE: trolox equivalent) hay IC50.
1.3. Phương pháp ORAC
Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxi hĩa của fluorescein khi cĩ sự hiện diện của gốc peroxy. Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox(hay vitamin E) và trong hiện diện của mẫu chứa chất chống oxi hĩa cần xác định hoạt tính. Khi fluorescein bị oxi hĩa, cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi. Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi thêm chất oxi hĩa vào. Khi cĩ mặt chất chống oxi hĩa, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn. Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính tốn. Kết quả tính tốn là mmol Trolox/g mẫu.
Ưu điểm của phương pháp ORAC là xác định được cĩ hoặc khơng cĩ sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxi hĩa. Đây là một điều rất thuận lợi khi đo các mẫu thực phẩm chứa cả những hợp chất chống oxi hĩa cĩ tốc độ phản ứng khác nhau nhiều.
Phương pháp TRAP sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2,2’-azobis(2- amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). Khi cho AAPH vào mơi trường plasma, các chất khử sẽ bị oxi hĩa. Quá trình oxi hĩa này được đo đạt thơng qua hàm lượng oxi tiêu thụ bằng một điện cực. Khi cĩ mặt chất chống oxi hĩa trong mơi trường plasma, quá trình oxi hĩa sẽ xảy ra chậm hơn. Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính tốn dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dài pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là dung dịch Trolox. Kết quả tính tốn là mmol Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/L mẫu lỏng.
1.5. Phương pháp FRAP
Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxi hĩa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxi hố trong việc khử phức Fe3+-TPTZ [2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+-TPTZ (màu xanh) ở pH thấp. Khi đĩ, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxi hĩa cĩ trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sĩng 593nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene).
Khi cho phức Fe3+-TPTZ vào mơi trường chứa chất chống oxi hĩa, các chất chống oxi hĩa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+-TPTZ. Kết quả tính tốn là mmol Fe2+/ g chất khơ. Do đĩ, khi kết quả tính tốn ra lớn thì chúng ta cĩ thể suy đốn rằng trong mơi trường phản ứng đĩ, số lượng các phân tử cĩ thể nhường điện tử là cao. Tuy nhiên, điều này khơng hồn tồn đúng vì một phân tử chất chống oxi hĩa cĩ thể khử nhiều phức Fe3+-TPTZ cùng lúc. Đây là một hạn chế của phương pháp FRAP.
1.6. Lipid assay
Phương pháp này đánh giá sự khác biệt trong tốc độ oxi hĩa acid linoleic bởi gốc ABAP trong mối quan hệ với chất chuẩn là tocopherol.
Trước và trong suốt quá trình xảy ra phản ứng, nhiệt độ của hỗõn hợp{[70 µL of linoleic acid (2,3 mmol/L)]; 100 mL đệm phosphate 0,05M (Natri phosphate hịa tan trong nước; 2.88 g SDS; pH 7.4)} được điều chỉnh và duy trì ở 40oC. Lấy 2µl của dung dịch này cho vào 0,01 ml ABAP(0,04M). Sau 2-5 phút phản ứng, lấy 0,02 ml dịch trích ly cho vào hỗn hợp này. Đo độ hấp thu của hỗn hợp ở 236nm. Xây dựng đường chuẩn là tocopherol.