Các tế bào E. coli mang plasmit sau khi nuôi cấy đến pha cân bằng thì được ly tâm thu lại. Thành và màng tế bào được phá vỡ bằng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt. Sau đó ADN hệ gen và protein được tủa lại bằng muối kali axetat và SDS, phần tủa bị loại bỏ khỏi ADN plasmit bằng ly tâm. ADN plasmit được tủa lại bằng etanol.
* Quy trình
-Cấy chuyển một khuẩn lạc của tế bào E. coli vào ống penixillin chứa 2 ml môi trường LBA, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC, 2000 vòng/phút.
-Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu tế bào.
-Hòa đều tế bào thu được với 100 µl Sol I bằng máy voltex, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 5phút.
-Bổ sung 200 µl Sol II. Đảo nhẹ nhàng để tránh đứt gãy ADN nhiễm sắc thể, đặt trên đá 5 phút
-Bổ sung tiếp 150 µl Sol III và đảo nhanh trong 10 giây. Trong hỗn hợp xuất hiện tủa trắng.
- Bổ sung 450 µl dung dịch hỗn hợp cholorofom: isoamylalcohol (24: 1) trộn đều
- ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút để loại protein và ADN nhiễm sắc thể
-Hút nhẹ nhàng pha trên khoảng 400 ỡl sang ống eppendorf mới, bổ sung thêm 400 µl dung dịch hỗn hợp cholorofom: isoamylalcohol, ly tâm 14000 vòng/phút trong 10 phút và tiếp tục hút nhẹ nhàng ở pha trên. Bằng cách này sẽ hút được nhiều hơn dung dịch ADN plasmit.
- ADN được tủa bằng hai lần thể tích cồn tuyệt đối 100%. Để dung dịch ở - 20oC trong trong 30 phút.
-Ly tâm thu ADN ở 13000 vòng/phút trong 10 phút. Phần kết tủa được rửa với cồn 70%, tiếp đến ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Thu tủa và làm khô bằng máy Speed Vac
- ADN plasmit được hòa vào 40 µl đệm TE.
- ARN lẫn trong sản phẩm tách chiết ADN được loại bỏ bằng ARNaza nồng độ 100µl/ml ủ ở 37oC trong 30 phút, giữ mẫu ở -20oC.
- ADN plasmit đã tách được điện di kiểm tra trên gel agaroza 0,8%