* Nguyên tắc
Vi khuẩn Salmonella được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng ở 37oC qua đêm đến khi OD600 = 0,5. Tế bào vi khuẩn được phá vỡ bằng lyzozim và SDS. Protein bám ADN và một số protein khác được phân giải bằng proteinaza K. Protein có khối lượng lớn còn lại sau khi xử lý với enzym được loại bỏ bằng cách ly tâm, protein nhỏ hoà tan vào dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol nằm ở pha dưới. ADN hệ gen ở pha trên được tủa lại bằng cồn và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%.
* Quy trình
- Nuôi cấy lắc một khuẩn lạc vi khuẩn S. typhimurium trong 10 ml môi trường LB lỏng ở 37oC, tốc độ máy lắc 200 vòng/phút qua đêm - Đổ dịch nuôi cấy vào các ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm 5000
vòng/phút trong 5 phút, thu lấy tế bào.
- Bổ sung 576 µl dung dịch TE, để trên đá và lắc đều cho tan hết tế bào
- Bổ sung 30 µl SDS 10%, lắc nhẹ và để ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung 3 µl enzim proteaza K (10 mg/ml), ủ ở 37oC trong 1 giờ. Sau đó thêm 180 µl NaCl 5M và lắc nhẹ, ủ ở 65oC trong 10 phút. - Protein được loại bằng chloroform/isoamylalcohol (24:1 v/v), ly
tâm thu dịch nổi. Dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới - Protein được loại bằng phenol/chloroform/isoamylalcolhol (25: 24:1). - Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, dùng pipet nhẹ nhàng hút
- ADN được tủa bằng hai lần thể tích etanol 100%, ủ mẫu ở nhiệt độ 4oC trong 20 phút.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch nổi, thu phần tủa là ADN hệ gen
- Rửa lại tủa bằng etanol 70%, làm khô tủa bằng máy Speed Vac - Hòa tan tủa bằng 40 µl TE có bổ sung 0,4 µl ARNaza 10 mg/ml - Điện di kiểm tra 1,5 µl dung dịch ADN hệ gen trên agaroza 0,8%