- Mẫu tế bào được nuôi cấy cảm ứng lượng lớn 200 ml bằng IPTG với nồng
3.2. Khuếch đại gen fljB bằng kĩ thuật PCR
Mục đích của chúng tôi là phân lập được gen fljB từ S. typhimurium và đưa vào biểu hiện trong E. coli BL21. Gen fljB là đoạn gen mã hoá cho kháng nguyên roi H: 1,2 có chiều dài 1,52 Kb nằm trong hệ gen của S. typhimurium. Dựa vào trình tự gen fljB của S. typhimurium trong ngân hàng gen, các đoạn mồi xuôi fljBf và mồi ngược fljBr được thiết kế có trình tự sau:
fljBf: 5’- tataccatggatgcacaagtaatcaacactaac- 3’ NcoI
fljBr: 5’- tatactcgagacgtaacagagacagcacgttc - 3’ XhoI
Trong kỹ thuật PCR trình tự mồi có vai trò quan trọng đặc trưng cho gen cần nhân lên, quyết đinh sự thành công của PCR. Với hai mồi như trên, chúng tôi thấy:
Hình 3.2. Phân tích ADN hệ gen trên gel agaroza 0,8%
Đường chạy 1: ADN hệ gen của S. typhimurium Đường chạy 2: Thang ADN chuẩn 1Kb
1,01,52,0 2,0 1,52,0 2,0 6,0 12 Kb ADN hệ gen 1 2
- Không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của cùng một mồi
- Thành phần nucleotit của hai mồi tương đương nhau, và đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại.
Sản phẩm PCR sẽ là một đoạn gen mà hai đầu có thêm trình tự nhận biết của hai enzim cắt hạn chế là Nco I và Xho I. Theo tính toán lý thuyết, đoạn gen fljB sau khi được khuếch đại bằng kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu sẽ có chiều dài 1,5 Kb. Sau khi thiết kế mồi chúng tôi đã kiểm tra sự dịch mã của đoạn gen fljB được nhân lên bằng hai mồi trong vectơ biểu hiện theo lý thuyết thấy gen sẽ được dịch mã chính xác. PCR được thực hiện ở điều kiện 2 mM MgCl2; 0,4 mM dNTP; 1 ỡM primer các loại và một 1 đơn vị Taq ADN polymeraza với chu trình nhiệt đã được mô tả ở phần phương pháp. Kỹ thuật PCR ADN polymeraza làm enzim tổng hợp chuỗi ADN có nguồn gốc từ loài vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus có khả năng tổng hợp chuỗi ở nhiệt độ cao 72oC. Ngoài ra enzim còn có đặc tính kéo dài chuỗi polynucleotit thêm 1 bazơ A ở đầu 3’ của mỗi sợi đơn. Hơn nữa để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nối ghép và tạo khung dịch mã đúng trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp, cặp mồi được thiết kế thêm vào trình tự cắt đặc hiệu cho hai enzim hạn chế Nco I và Xho I, nên khi xử lý bằng enzim hạn chế Nco I và Xho I sẽ cho ra đoạn ADN với hai đầu so le. Đây chính là cơ sở tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nối ghép sau này. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel điện di agaroza 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 3.3.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agaroza cho thấy, sản phẩm là một băng sáng rõ nét, đặc hiệu, có kích thước khoảng 1,5 Kb, đúng theo tính toán. Kết quả này đã khẳng định chương trình chạy cho kỹ thuật PCR là phù hợp, cặp mồi thiết kế đặc hiệu. Sản phẩm PCR đủ điều kiện để tiến hành các bước tiếp theo.
Từ sự thành công ở bước nhân dòng gen này đã tạo điều kiện thuận lợi cho bước đưa gen fljB vào vector tách dòng.