- Mẫu tế bào được nuôi cấy cảm ứng lượng lớn 200 ml bằng IPTG với nồng
3.3.2. kiểm tra plasmit tái tổ hợp pCRfljB bằng enzim hạn chế
Sau khi thu được plasmit tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra bằng enzim hạn chế. Chúng tôi đã sử dụng bản đồ cắt giới hạn của vector PCR2.1 và của đoạn fljB để tìm các enzim kiểm tra phù hợp. Sau khi nghiên cứu chi tiết sự phù hợp giữa các enzim trên bản đồ cắt giới hạn, và enzim có trong phòng thí nghiệm, chúng tôi quyết định chọn enzim Nco I, Xho I, EcoR I để cắt kiểm tra gen fljB và trên vector. Kết quả xử lý plasmit bằng các enzim hạn chế được kiểm tra trên gel agaroza 0,8% ở các hình sau.
pCRfljB pCR2.1
1 2 3 4
Hình 3.5. Phân tích sản phẩm tách chiết ADN plasmit tách dòng trên
gel agaroza 0,8%
Đường chạy 1: plasmit đối chứng không mang gen pCR2.1.
Hình 3.6. Phân tích sản phẩm cắt plasmit pCRfljB bằng enzim Nco I trên gel agaroza 0,8%
Đường chạy 1: Thang ADN chuẩn 1 Kb (Gibco) Đường chạy 2-3: pCRfljB
Enzim Nco I có một vị trí cắt ở đầu mút của gen fljB và một nằm trong vectơ. Nếu gen đưa vào là xuôi chiều với promotor thì sản phẩm cắt có hai băng có kích thước 3,2 Kb và 2,2 Kb. Còn nếu là gen đưa vào là ngược chiều thì sản phẩm cắt có kích thước là 1,6 Kb và 3,8 Kb. Trên điện di đồ hình 3.6 (a) có các đoạn ADN với kích thước đúng như tính toán. Dòng pCRfljB trên đường chạy 2 là dòng mang gen fljB xuôi chiều với promoter lac, còn dòng pCRfljB trên đường chạy 3 là dòng mang gen fljB ngược chiều với promoter lac
Tương tự như vậy đối với enzim Xho I cũng có 1 điểm cắt trên vector và sát trên gen fljB. Nếu gen đưa vào là xuôi chiều với promoter thì sản phẩm cắt có hai băng với kích thước là 5,42 Kb 1,52 Kb và 3,9 Kb. Còn gen đưa vào là ngược chiều thì sản phẩm cắt có kích thước là1,52 Kb và 3,9 Kb. Kết quả được điện di kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. Hình 3.7 cho thấy dòng pCRfljB trên đường chạy 2 là dòng mang gen ngược chiều với promoter lac.
Kb 3,2Kb 3,8Kb 1 2 3 2,0 1,5 1,0 0,5 4,0 2,2Kb 1,6Kb 6,0
Còn dòng pCRfljB trên đường chạy 3 là dòng mang gen xuôi chiều với promoter lac.
Enzim EcoR I có hai điểm cắt nằm ở hai vùng đa nối trên vector pCR21, đồng thời gen fljB không chứa trình tự EcoR I. Vì thế đối với enzim EcoR I sẽ có hai điểm cắt nằm ở hai vùng đa nối trên vectơr pCR2.1, khi chèn đoạn gen ngoại lai vào nếu là xuôi, hay ngược chiều thì vẫn nằm giữa hai điểm cắt của enzim EcoR I. Khi cắt plasmit tái tổ hợp mang fljB thì sản phẩm cắt sẽ có hai đoạn ADN với kích thước 1,52 Kb, và 3,9 Kb. Còn trên vectơ pCR2.1 đối chứng khi cắt bằng enzim này chỉ cho một băng có kích thươc 3,9 Kb. Kết quả trên điện di đồ hình 3.8 cho thấy hai băng ADN rõ nét với kích thước đúng như tính toán. Do đó, bước đầu, chúng tôi khẳng định đã tách dòng
1 2 3 2,0 2,0 4,06,0 0,5 1,0 Kb 1,52Kb 3,9Kb 5,42Kb Hình 3.7. Phân tích sản phẩm cắt plasmit pCRfljB bằng
XhoI trên gel agaroza
Đường chạy 1: Thang ADN chuẩn 1 Kb (Gibco) Đường chạy2-3: PCRfjB
thành công gen fljB trong vector PCR2.1. Vector tái tổ hợp mang gen fljB được đặt tên là pCRfljB.
c