Vi sinh vật tổng số là tất cả các vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển được trên môi trường dinh dưỡng chung, ở nhiệt độ 30˚C sau một thời gian nuôi cấy nhất định (24-72h).
Xác định chỉ tiêu vi sinh vật để đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan Nguyên tắc của phương pháp:
Nuôi cấy một lượng mẫu nhất định hoặc mẫu đã pha loãng lên môi trường thạch dinh dưỡng ở nhiệt độ 30˚C trong điều kiện hiếu khí, thời gian 48-72h. đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trên đó. Từ tổng số khuẩn lạc đếm được sẽ suy ra lượng vi sinh vật tổng số có trong mẫu phân tích.
Phương pháp này chỉ xác định được vi sinh vật hiếu khí. Trên bề mặt rau quả vi sinh vật chủ yếu là các nấm mốc hiếu khí nên có thể dùng phương pháp này để đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan.
Hóa chất môi trường:
- Môi trường TGA (Trypton, Glucoza, Aga): Trypton hoặc Pepton 5g; glucoza 4g; cao nấm men 2,5g; thạch 15g; nước cho đủ 1l. Môi trường hấp khử trùng ở 121˚C trong thời gian 20 phút.
- Thạch màng: dung dịch nước thạch 1%
- Dung dịch pha loãng: nước cất hoặc nước muối sinh lý vô trùng Tiến hành:
- Rửa sạch và vô trùng các dụng cụ và dịch pha loãng.
- Bóc vỏ cà chua trong điều kiện vô trùng. Cân một lượng vỏ nhất định sau đó nhúng vào trong nuớc muối sinh lý.
- Pha loãng thập phân mẫu phân tích tới nồng độ phù hợp để dễ dàng cho việc đếm khuẩn lạc. Thời gian thao tác không quá 30 phút.
Mức Điểm Mức Điểm
Tốt 18,6-20,0 Kém 7,2-11,11
Khá 15,2-18,5 Rất kém 4,0-7,1
- Cấy trên bề mặt thạch: môi trường sau khi đã hấp khử trùng rót vào đĩa petri, mỗi đĩa cho 5-18 ml môi trường. Xếp các đĩa trên mặt phẳng nằm ngang, để yên cho đến khi thạch nguội và đông hoàn toàn (có thể để 2-3 ngày ở nhiệt độ 30˚C để kiểm tra độ vô trùng của các hộp). Khi cấy chọn các hộp petri hoàn toàn vô trùng.
- Lấy 0,05 ml (một giọt) mẫu đã pha loãng cho vào hộp petri (mỗi độ pha loãng làm 3 hộp và làm 2 cấp pha loãng liên tiếp nhau) đã chúa môi trường thạch dinh dưỡng, trang đều trên bề mặt thạch.
- Lật ngược đĩa, đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 30˚C trong thời gian 24-72 giờ.
Kết quả.
Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số khuẩn lạc trên hộp petri trong khoảng 30-300. Nếu ở ngay đĩa cấy mẫu nguyên chất không pha loãng đã có số khuẩn lạc nhỏ hơn 30 thì lấy kết quả đó.
Lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu được tính theo công thức: ( 1 2) 1
C N =
0,1 . .
n +∑n f v
ΣC- tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa 1
n - số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất 2
n -số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ hai 1
f - hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất v- thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petri