Kết quả khảo sát khả năng ức chế tyrosinase của 11 mẫu cao được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3. 1: Kết quả khảo sát khả năng ức chế tyrosinase của các mẫu cao
STT Mẫu cao I% Ức chế theo nồng độ μg/mL IC50 100 50 25 10 5 1 M 74.123±0.002gh 65.132±0.002d 67.105±0.002e 67.325±0.002g 62.061±0.001g <5 2 C 17.105±0.009a 33.772±0.022ab 45.855±0.062ab 5.263±0.003a 6.579±0.006a >100 3 Cắn 42.74±0.002bcd 35.342±0.004abc 30.137±0.003bc 27.854±0.005c 21.005±0.004cd >100 4 E 57.675±0.007ef 48.684±0.001c 47.588±0.002d 36.404±0.004d 30.921±0.004e 57.317 5 TI-A 40.183±0.002bc 23.653±0.002a 23.744±0.004abc 15.89±0.003b 14.338±0.002bc >100 6 TI-B 35.434±0.007b 33.607±0.005ab 19.361±0.002ab 14.247±0.004b 11.872±0.006ab >100 7 TI-C 45.662±0.003cd 38.813±0.015bc 35.525±0.005cd 25.936±0.003c 22.831±0.002d >100 8 TI-D 50.219±0.004de 40.57±0.008bc 11.842±0.015a 11.842±0.008b 4.167±0.01a 98.864 9 TI-E 76.535±0.002h 69.518±0.004d 67.544±0.003e 58.114±0.004ef 53.289±0.002f <5 10 TI-F 65.789±0.012fg 70.175±0.002d 67.544±0.004e 64.254±0.002fg 55.263±0.001fg <5 11 TI-G 69.956±0.001gh 65.351±0.002d 62.061±0.001e 60.088±0.005f 54.605±0.002f <5
Dữ liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-h) ở cùng một hàng thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về giá trị nồng độ của các mẫu cao theo kiểm định Tukey.
M: cao methanol C: cao cloroform E: cao ethyl acetate Các mẫu: cao methanol thô, phân đoạn từ TI-E đến TI-G thể hiện khả năng ức chế khá tốt với phần trăm ức chế đều lớn hơn 50% tại nồng độ 5 μg/mL. Tại nồng độ mẫu 25 μg/mL, các mẫu trên đều cho phần trăm ức chế tốt với các giá trị đều lớn hơn 60%. Phần trăm ức chế của cao methanol, TI-E đến TI-G ở nồng độ 100 μg/mL lần lượt
34
là 74.123%, 76.535%, 65.789%, 69.956%, cho thấy hoạt tính ức chế tyrosinase rất tốt. Thông quá giá trị ở bảng 3.1, ta thấy rằng 4 mẫu cao trên đều thể hiện hoạt tính enzyme rất tốt và khả năng ức chế tăng dần theo nồng độ.
Cắn, cao cloroform và mẫu phân đoạn TI-A đến TI-D ở nồng độ 5 μg/mL hoạt tính ức chế rất yếu, đặc biệt là cao cloroform và phân đoạn TI-D với giá trị %I lần lượt: 6.579%, 4.167%. Tại nồng độ 25 μg/mL, mẫu cao cloroform thể hiện hoạt tính trung bình (45.855%), mẫu TI-C và cắn thể hiện hoạt tính yếu: 35.525% và 30.137%. các mẫu còn lại TI-A, TI-B, TI-D cho thấy khả năng ức chế rất yếu với %I <20%. Dù ở nồng độ cao hơn là 100 μg/mL, 6 mẫu trên không cho thấy khả năng ức chế tốt, %I <50%.
Qua những giá trị %I tại các nồng độ khác nhau, chúng ta có được giá trị IC50: Các mẫu cao phân đoạn từ cao ethyl acetate: TI-E, TI-F, TI-G, cao methanol thô thể hiện hoạt tính rất mạnh với giá trị IC50 <5. Mẫu cao ethyl acetate cho giá trị IC50= 57.317 μg/ml cho thấy khả năng ức chế tyrosinase ở mức trung bình. Mẫu cao cloroform qua khảo sát thể hiện khả năng ức chế enzyme yếu. Các mẫu cao phân đoạn từ TI-A đến TI- C và mẫu cắn thể hiện hoạt tính ức chế rất yếu, giá trị IC50 >100.
Nhìn chung, các mẫu trên đều cho kết quả ức chế nhỏ yếu hơn acid kojic.
Acid kojic được sử dụng làm chất đối chứng dương với giá trị IC50 <5 μM ( bảng 3.2).
Bảng 3. 2: Kết quả khả năng ức chế của acid koijic
Mẫu % Ức chế theo nồng độ μM IC50 100 50 25 10 5 Acid Kojic 89.91±0.38k 80.92±1.31l 82.01±1.65l 74.78±0.38l 71.49±1.00k <5 3.2. Khảo sát khả năng khử Cu2+
3.2.1. Khảo sát thể tích CuCl2, BCDS, catechine
Quá trình khảo sát thể tích tối ưu cho khả năng ức chế Cu2+ được thực hiện lần lượt từ các thành phần CuCl2, BCDS và chất chuẩn catechin. Sau khi chuẩn bị hỗn hợp mẫu trắng và mẫu đo, mẫu được đo độ hấp thu quang trong khoảng bước sóng 300 – 800 nm. Ở thể tích nào cho kết quả độ hấp thu cao nhất thì thể tích đó là tối ưu. Ở đây, bước sóng mà tại đó tất cả các thể tích có độ hấp thu cao nhất là 480 nm.
35
Bảng 3. 3: Kết quả khảo sát thể tích CuCl2, BCDS, catechine
Thể tích CuCl2 (μL) Giá trị độ hấp thu Thể tích BCDS (μL) Giá trị độ hấp thu Thể tích Catechine (μL) Giá trị độ hấp thu 300 0.05±0.004a 300 0.026±0.012a 30 0.046±0.001a 400 0.045±0.005a 400 0.026±0.009a 40 0.077±0.036a 500 0.088±0.004bc 500 0.061±0.002b 50 0.091±0.018a 600 0.054±0.018a 600 0.038±0.005ab 60 0.062±0.003a 700 0.11±0.011c 700 0.028±0.004a 70 0.086±0.009a 800 0.069±0.001ab 800 0.049±0.002ab 80 0.101±0.012a 900 0.066±0.005ab 900 0.039±0.01ab 90 0.099±0.028a 1000 0.065±0.001ab 1000 0.039±0.008ab 100 0.076±0.006a
Dữ liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-c) ở cùng một hàng thể hiện sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về giá trị nồng độ của các mẫu cao theo kiểm định Tukey.
Qua việc khảo sát thể tích từng thành phần CuCl2, BCDS và catechine đã nêu ở bảng 3.3 có thể so sánh giá trị hấp thu quang của từng thể tích để lựa chọn thể tích tối ưu cho phương pháp này. Theo đó, đối với CuCl2 trong khoảng thể tích từ 300-1000 μL thì tại giá trị V = 700 μL đạt giá trị độ hấp thu quang cao nhất, nên ta chọn đó là thể tích tối ưu cho thành phần này. Tương tự phép so sánh đó, thể tích tối ưu cho BCDS là 500 μL và catechine là 80 μL. Bảng 3.4 thể hiện kết quả thể tích tối ưu cho phương pháp ức chế Cu2+ và được áp dụng cho tất cả các loại mẫu cao trong nghiên cứu này.
Bảng 3. 4: Kết quả thể tích tối ưu phương pháp ức chế Cu2+
Thành phần Thể tích tối ưu (μL)
36
Dung dịch CuCl2 800μM 700
Dung dịch BCDS 3600μM 500
Đệm MOPS pH = 7.4 3000 - ( 80+700+500) = 1720
3.2.2. Kết quả khảo sát khả năng khử Cu2+ trên các mẫu cao
Bảng 3. 5: Kết quả khả năng khử Cu2+ của các mẫu cao trích
STT Mẫu cao Độ hấp thu theo nồng độ (mg/ml)
0.1 0.5 1 1 M 0.721±0.015abc 1.152±0.082ef 1.333±0.057d 2 C 0.741±0.103abc 0.711±0.082ab 0.826±0.063bc 3 Cắn 0.741±0.078abc 0.917±0.077cd 0.702±0.071ab 4 E 0.628±0.056a 1.05±0.069de 1.379±0.092d 5 TI-A 0.583±0.025a 0.647±0.036a 0.718±0.033b 6 TI-B 0.679±0.043ab 0.685±0.079ab 0.49±0.012a 7 TI-C 0.582±0.02a 0.861±0.07bc 0.844±0.017bc 8 TI-D 0.864±0.045c 1.176±0.003ef 1.997±0.024e 9 TI-E 0.687±0.013ab 0.927±0.029cd 0.977±0.011c 10 TI-F 0.827±0.071bc 1.465±0.074g 1.949±0.171e 11 TI-G 0.721±0.015abc 1.152±0.082ef 1.333±0.057d
Dữ liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3). Các trung bình với chữ cái khác nhau (a-g) ở cùng một hàng thể hiện sự khác biệt đáng kể (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(p < 0,05) về giá trị nồng độ của các mẫu cao theo kiểm định Tukey
37
Kết quả khảo sát khả năng khử Cu2+ của 11 mẫu cao được thể hiện ở bảng 3.5. Giá trị độ hấp thu quang càng lớn cho thấy khả năng chuyển hóa Cu2+ thành Cu+ càng cao. Khảo sát trên cho thấy mẫu cao methanol thô, mẫu E, TI-D, TI-F, TI-G tại nồng độ mẫu 1 mg/ml cho hiệu quả khử Cu2+ vượt bậc so với các mẫu khác, độ hấp thu quang lần lượt: 1.333, 1.379, 1.997, 1.949, 1.333. Cùng với 4 mẫu cao trên, cao cloroform, TI- A, TI-C, TI-E đều cho thấy khả năng khử đồng tăng dần theo nồng độ. Tuy nhiên, mẫu cắn và phân đoạn TI-B lại cho giá trị hấp thụ quang giảm dù tăng nồng độ, lần lượt ở nồng độ 0.1 mg/ml và 1 mg/ml là 0.741 và 0.702, 0.679 và 0.490. Nhìn chung, tất cả các mẫu cao trên đều có khả năng khử đồng, cho thấy hàm lượng flavonoid và polyphenol có trong các mẫu khá cao.
Như vậy, sau khi thử hoạt tính của 11 mẫu cao bằng 2 phương pháp, nhận thấy rằng các mẫu cao đều có khả năng ức chế enzyme và năng lực khử đồng. Trong đó, TI- F và TI-G cho thấy khả năng ức chế tốt nhất trên cả hai phương pháp.
3.3. Khảo sát cấu trúc hợp chất TI-C01
Hình 3. 1: Cấu trúc hợp chất β-sitosterol (TI-C01)
Đặc điểm:
Hợp chất TI-C01 (50 mg) thu được từ phân đoạn TI-C3.2 có những đặc điểm như sau:
38
- Sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexan:acetone (9:1) thấy hiện vết tròn
Rf= 0.65 và không hiện dưới đèn UV. Hiện màu bằng dung dịch Anilin/ H2SO4 nung nóng xuất hiện màu tím.
- Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (bảng 3.6) - Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (bảng 3.6).
Biện luận cấu trúc:
Phổ 1H và 13C của hợp chất TI-C01 xuất hiện 6 tín hiệu của nhóm methyl tại δH
0.72 (3H, s, 18-Methyl), 1.01(3H, s, 19-Methyl), 0.96 (3H, d, J = 6.6-Methyl), 0.83
(3H, d, J = 6.9, 26-Methyl), 0.85 (3H, d, J =6.9 , 27-Methyl), 0.87 (3H, t, J =7.4, 29- Methyl) và 29 tín hiệu carbon cho thấy đây là một sterol với khung stigmastan.
Thêm vào đó, phổ 13C-NMR xuất hiện cặp mũi tại δC 141.4 (C-5) và 120.67 (C- 6) cho thấy sự hiện diện của liên kết >C=CH-, là cặp mũi cộng hưởng đặc trưng cho khung stigmastan-5-ene. Ngoài ra, phổ còn có mũi cộng hưởng tại δC 70.84 (C-3) tương ứng với tín hiệu nhóm oxymethine tại δH 3.41 (1H, m, H-3).
Bảng 3. 6: Số liệu phổ của hợp chất TI-C01 với β-sitosterol Vị
trí
Loại C Hợp chất TI-C01 (CDCl3) β-sitosterol (CDCl3)
δH δC δH δC 1 -CH2- 37.36 37.3 2 -CH2- 31.61 31.6 3 >CH- 3.41 (1H, m) 70.84 3.52 (1H, m) 71.7 4 -CH2- 42.43 42.2 5 >C< 141.46 140.7 6 =CH- 5.32 m 120.67 5.35 m 121.6 7 -CH2- 31.92 32.0 8 >CH- 31.75 31.8
39 9 >CH- 50.35 51.1 10 >C< 36.58 36.4 11 -CH2- 20.92 21.3 12 -CH2- 39.80 39.8 13 >C< 42.43 42.4 14 >CH- 56.79 56.8 15 -CH2- 24.06 24.2 16 -CH2- 28.06 28.3 17 >CH- 56.07 56.0 18 -CH3 0.72 s 11.39 0.69 s 11.8 19 -CH3 1.01 s 19.20 1.01 s 19.5 20 >CH- 36.04 36.1 21 -CH3 0.96 d (6.6) 18.34 0.92 d (6.4) 18.7 22 -CH2- 33.84 34.0 23 -CH2- 25.93 26.1 24 >CH- 45.86 45.8 25 >CH- 29.06 29.2 26 -CH3 0.85 d (6.9) 18.91 0.83 d (6.8) 19.8 27 -CH3 0.84 d (6.9) 18.47 0.81 d (6.9) 19.2 28 -CH2- 22.89 23.1 29 -CH3 0.87 t (7.4) 11.35 0.85 t (7.8) 11.0
40
( trị số trong ngoặc là J tính bằng Hz)
So sánh số liệu phổ của TI-C01 với β-sitosterol cho thấy sự tương đồng (bảng 3.6), do đó cấu trúc của TI-C01 được đề nghị là β-sitosterol [60].
41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Từ hạt me, điều chế được 3 mẫu cao thô gồm: cao methanol, cao cloroform, cao ethyl acetate. Tiến hành sắc ký cột cao ethyl acetate thu được 7 phân đoạn từ TI-A đến TI-F. Tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase và khả năng khử Cu2+
Qua việc khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase và khả năng khử Cu2+ của 11 mẫu cao phân đoạn được trích từ hạt cây me, các mẫu đều có hoạt tính ức chế enzyme và khử đồng. Trong đó, 4 mẫu: cao methanol thô và mẫu từ phân đoạn TI-E đến TI-G được tách từ cao ethyl acetate thể hiện khả năng ức chế enzyme rất mạnh, vượt trội hơn so với các phân đoạn khác, giá trị IC50 <5. Nhưng do điều kiện phòng thí nghiệm nên chỉ sử dụng acid kojic làm đối chưng dương. Chúng ta có thể đánh giá hàm lượng các hợp chất polyphenol và flavonoid có trong 4 mẫu trên là khá cao. Việc khảo sát thể tích tối ưu của các thành phần ức chế Cu2+ cũng là điểm mới của đề tài. Thực nghiệm về thử khả năng khử Cu2+, 4 mẫu trên và phân đoạn TI-D cho kết quả độ hấp thu quang cao hơn hẳn các phân đoạn khác, cho thấy khả năng khử đồng của 5 mẫu này rất mạnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đây là nghiên cứu đầu tiên của hạt me về hoạt tính ức chế tyrosinase, tạo cơ sở định hướng ứng dụng của hạt me và cao phân đoạn vào mỹ phẩm với mục tiêu sáng da và trị nám
Bên cạnh đó, phân lập và định danh thành công hợp chất β-sitosterol từ phân
đoạn TI-C tách từ cao ethyl acetate.
Kiến nghị
Thực hiện các nghiên cứu về thành phần hóa học trong các phân đoạn cao, đặc biệt là 4 mẫu: cao methanol thô và mẫu từ phân đoạn TI-E đến TI-G cho khả năng ức chế tyrosinase rất mạnh.
Tiến hành thử khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn và thử độc tính để mở rộng ứng dụng cho các sản phẩm trong các ngành công nghiệp, đặc biệt là trong lĩnh vực mỹ phẩm.
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] G. P. Lewis, Legumes of the World. Royal Botanic Gardens Kew, 2005. [2] T. L. Đỗ, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Y học, 2004.
[3] M. Ali, V. Ahmad, I. Azhar, and K. J. F. Usmanghani, "Chemotropism and antimicrobial activity of Tamarindus indica," vol. 69, no. 1, pp. 43-46, 1998. [4] K. El-Siddig, Tamarind: Tamarindus Indica L. Crops for the Future, 2006. [5] M. J. Christenhusz and J. W. J. P. Byng, "The number of known plants species
in the world and its annual increase," vol. 261, no. 3, pp. 201-217, 2016.
[6] W. S. Judd, C. S. Campbell, E. A. Kellogg, P. F. Stevens, and M. J. Donoghue,
Plant systematics. Sinauer Sunderland, Massachusetts, USA, 2002.
[7] P. J. A. P. W. V. Stevens, "Fabaceae," vol. 7, 2006.
[8] S. Magallon and M. J. J. E. Sanderson, "Absolute diversification rates in angiosperm clades," vol. 55, no. 9, pp. 1762-1780, 2001.
[9] R. J. Burnham and K. R. J. P. T. o. t. R. S. o. L. S. B. B. S. Johnson, "South American palaeobotany and the origins of neotropical rainforests," vol. 359, no. 1450, pp. 1595-1610, 2004.
[10] N. T. J. N. K. Đỏ and t. KT, "Thực vật chí Việt Nam 8," vol. 8, p. 510, 2007. [11] P. Nyadoi et al., "Tamarinds (Tamarindus indica L.) niche tree species diversity
characterisation reveals conservation needs and strategies," vol. 1, no. 5, pp. 151- 176, 2009.
[12] E. De Caluwé, K. Halamová, and P. J. A. f. Van Damme, "Tamarindus indica L.: a review of traditional uses, phytochemistry and pharmacology," vol. 23, no. 1, pp. 53-83, 2010.
[13] S. Jana, D. Lakshman, K. K. Sen, and S. K. J. I. J. P. S. D. R. Basu, "Development and evaluation of epichlorohydrin cross-linked mucoadhesive patches of tamarind seed polysaccharide for buccal application," vol. 2, pp. 193-198, 2010. [14] J. J. T. J. o. P. R. Doughari, "Antimicrobial activity of Tamarindus indica Linn,"
vol. 5, no. 2, pp. 597-603, 2006.
[15] S. Garg, T. Muangman, H. Huifu, L. Ling, S. C. Kaul, and R. Wadhwa, "Bioactivities in the tamarind seed extracts: A preliminary study," in AIP Conference Proceedings, 2018, vol. 1929, no. 1, p. 020011: AIP Publishing.
[16] P. J. L.-F. S. Siddhuraju and Technology, "Antioxidant activity of polyphenolic compounds extracted from defatted raw and dry heated Tamarindus indica seed coat," vol. 40, no. 6, pp. 982-990, 2007.
43
[17] L. Fan et al., "Synthesis and anticoagulant activity of sodium alginate sulfates," vol. 83, no. 4, pp. 1797-1803, 2011.
[18] T. Tsuda et al., "Antioxidative components isolated from the seed of tamarind (Tamarindus indica L.)," vol. 42, no. 12, pp. 2671-2674, 1994.
[19] J. J. S. Purseglove and Technology, "Tropical crops. Dicotyledons, Longria," pp. 204-206, 1987.
[20] N. J. J. o. F. S. Shankaracharya and Technology, "Tamarind-chemistry, technology and uses-a critical appraisal," vol. 35, no. 3, pp. 193-208, 1998. [21] K. J. T. t. f. f. A. Chapman, "Tamarind," Complied by Page PE. Queensland
Department of Primary Industries, Information series Q
vol. 183018, pp. 83-86, 1984. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[22] Feungchan, S Yimsawat, T. Chindaprasert, and S. Kitpowsong, "Tamarind (Tamarindus indica L.) Plant genetic resources in Thailand," vol. 1, pp. 1-11, 1996.
[23] W. W. Leung and M. J. Flores, "INCAP-ICNND food composition table for use in Latin America," 1961.
[24] S. Panigrahi, B. Bland, P. J. A. F. S. Carlaw, and Technology, "The nutritive value of tamarind seeds for broiler chicks," vol. 22, no. 4, pp. 285-293, 1989. [25] M. M. Ishola, E. B. Agbaji, A. S. J. J. o. t. S. o. F. Agbaji, and Agriculture, "A
chemical study of Tamarindus indica (Tsamiya) fruits grown in Nigeria," vol. 51, no. 1, pp. 141-143, 1990.
[26] H. Mohamed, B. Mohamed, K. J. J. o. F. P. Ahmed, and Technology, "Physicochemical Properties of Tamarind (Tamarindusindica) Seed Polysaccharides," vol. 6, no. 6, pp. 1-5, 2015.
[27] B. O. De Lumen, R. Becker, P. S. J. J. o. A. Reyes, and F. Chemistry, "Legumes and a cereal with high methionine/cysteine contents," vol. 34, no. 2, pp. 361-364, 1986.
[28] R. Andriamanantena, J. Artaud, E. Gaydou, M. Iatrides, and J. J. J. o. t. A. O. C. S. Chevalier, "Fatty acid and sterol compositions of Malagasy Tamarind kernel oils," vol. 60, no. 7, pp. 1318-1321, 1983.
[29] K. Bhattacharya, S. Bal, R. J. J. o. F. S. Mukherjee, and Technology, "Studies on the characteristics of some products from tamarind (Tamarindus indica) kernel," vol. 31, no. 5, pp. 372-376, 1994.