Nguyên tắc: Trong môi trường đệm pH= 7.2-7.4, phức BCDS2Cu(I) được phát
hiện màu đỏ cam tại bước sóng 480 nm. Sự có mặt của flavonoid trong thành phần sẽ chuyển Cu2+ thành Cu+, tạo ra phức chất có màu đỏ cam [56]. Phức chất này chỉ tồn tại ở dạng ion Cu+ [57]. Vì vậy, mẫu cao có nồng độ flavonoid càng cao thì sẽ tạo ra phức chất càng đậm màu.
Cơ chế tạo thành phức BCDS2Cu(I) được tiến hành theo 2 giai đoạn [58, 59] (hình ).
26
Hình 2. 3: Tạo phức đồng chelate giai đoạn 2
Sơ đồ 2. 4: Quy trình khảo sát khả năng tạo phức đồng chelate Thuyết minh sơ đồ 2.4:
Hóa chất: Mẫu chuẩn catechin nồng độ 350 μM
Mẫu khảo sát chuẩn bị ở nồng độ 10 mg/mL Dung dịch BCDS 3600 μM
Dung dịch CuCl2 800 μM Đệm MOPS pH = 7.4
27
Quy trình: khảo sát dựa vào cải tiến của Mira và cộng sự. Tiến hành khảo sát thể
tích các dung dịch để tìm ra V1, V2, V3, V4 là các điều kiện thể tích tối ưu .
Với tổng dung dịch mỗi lần khảo sát là 3000μL, lần lượt khảo sát thể tích các dung dịch CuCl2, BCDS, catechin (mẫu) bằng cách cố định các thể tích khác thông qua nồng độ làm việc tương ứng. Ủ dung dịch sau 2h, thực hiện scan bước sóng từ 300 - 800nm, ứng với vị trí có λmax. Lựa chọn thể tích tối ưu là tại đó có độ hấp thu quang cao nhất. Tiếp tục khảo sát các thể tích tiếp theo sau khi cố định thể tích đã khảo sát trước đó. Thể tích MOPS cần tối ưu là phần còn lại trong 3000μL.
Sau khi tối ưu hóa, thực hiện đo độ hấp thu quang trên các mẫu cao với các nồng độ làm việc là 1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.1 mg/mL. Cho hỗn hợp lượng mẫu và các thành phần khác ủ trong 2h. Tiến hành đo độ hấp thu và so sánh kết quả.
Lưu ý: Mẫu trắng ở các thí nghiệm là mẫu không chứa BCDS. Thành phần BCDS
được thay thế bằng lượng đệm MOPS.