Nguyên tắc: Trong môi trường pH = 6.8, tyrosynase chuyển hóa chất L-DOPA
thành DOPAchrom có màu đỏ cam hấp thụ bước sóng cực đại λmax = 475 nm. Mẫu cao trích được cho vào dung dịch đệm gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, từ đó việc chuyển hóa L- DOPA sẽ giảm đi, cường độ hấp thụ quang cũng sẽ giảm. Từ kết quả đo độ hấp thụ ở các nồng độ khác nhau mà chúng ta có thể đánh giá khả năng ức chế enzyme của các mẫu cao trích thông qua phần trăm ức chế và giá trị IC50.
Hình 2. 1: Chuyển hóa L-DOPA thành DOPAchrom dưới tác động của tyrosinase
24
Sơ đồ 2. 3: Quá trình khảo sát khả năng ức chế tyrosinase Thuyết minh sơ đồ 2.3:
Chuẩn bị dung dịch: Pha đệm phophate ở pH= 6.8 nồng độ 0.1 M: cho 140 mL
dung dịch Na2HPO4 0,2 M và 144 mL dung dịch NaH2PO4 0,5 M đổ vào becher 1000 mL. Thêm nước cất 2 lần và chỉnh đệm đến pH = 6,8. Sau đó định mức trong bình định mức 1000 mL.
Dung dịch L-DOPA nồng độ 1.5 mM: cân 29,58 mg L-DOPA, định mức chất nền trong bình định mức 100 mL định mức bằng đệm phosphate.
Tyrosinase từ nấm: 2687 U/mg; 25000 U/9.31mg pha trong 83 mL đệm phosphate.
Mẫu khảo sát được chuẩn bị ở nồng độ đầu là 1000 μg/mL với đệm phosphate.
Quy trình: Cho 100 μL tyrosinase 300 U/ml vào mẫu khảo sát sau đó được ủ
trong tủ lạnh trong 30 phút. Sau đó, hỗn hợp được thêm vào 1000 μL chất nền L-DOPA, lắc đều và đợi trong 7 phút rồi tiến hành đo quang tại bước sóng λmax= 475 nm.
Tổng thể tích cho mỗi lần đo là 3000 μL. Mẫu khảo sát được đo lần lượt ở các nồng độ sau: 100, 50, 25, 10, 5 μg/mL. Dung dịch mẫu trắng chứa lượng chất nền tương tự như mẫu đo, tuy nhiên lượng enzyme sẽ được thay bằng lượng đệm tương ứng. Mẫu đối chứng là dung dịch không chứa mẫu cao trích.
25
Mỗi mẫu nồng độ sẽ được đo 3 lần và lấy giá trị trung bình. Ứng với mỗi giá trị trung bình, tính được phần trăm ức chế enzyme từng nồng độ, từ đó xác định được IC50
của mẫu và so sánh giữa các mẫu với nhau. Giá trị IC50 càng bé chứng tỏ khả năng ức chế enzyme càng hiệu quả.
Phần trăm ức chế được tính theo công thức: I% = 𝐴−𝐵
𝐴 × 100
Trong đó: A- Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ mẫu đối chứng B- Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ mẫu cao
Cơ sở để đánh giá khả năng ức chế của những mẫu khảo sát được so sánh với chất đối chứng dương. Trong nghiên cứu này, acid kojic được chọn làm chất đối chứng dương, acid kojic là chất ức chế tyrosinase mạnh.