Sau 20 ngày và 35 ngày nuôi cấy, phôi dừa đã tạo được chồi và rễ rất tốt trên môi trường Y3 có bổ sung GA3 20 mg/l và nước dừa Ta 11 tháng 10%.
Ảnh 3.82. Phôi dừa Sáp sau 20 ngày Ảnh 3.83. Phôi dừa Sáp sau 35 ngày
nuôi cấy trên môi trường Y3 nuôi cấy trên môi trường Y3
có bổ sung GA3 20 mg/l và có bổ sung GA3 20 mg/l và
nước dừa Ta 11 tháng 10% nước dừa Ta 11 tháng 10%
THẢO LUẬN
Các biến đổi sinh hóa, sinh lí trong quá trình nảy mầm
Nước là yếu tố cần thiết cho sự nảy mầm, là điều kiện cần cho hoạt hóa enzyme, phân giải, chuyển hóa và sử dụng các nguồn năng lượng dự trữ (Miller, 2000). Nước thúc đẩy quá trình nảy mầm. Trước khi ươm, ngâm quả dừa vào nước trong 2 tuần sẽ rút ngắn thời gian cần cho sự nảy mầm (chỉ còn 81 ngày so với 142 ngày nếu không xử lý) (Thomas, 1973). Trong quả dừa, nước dừa là nguồn cung cấp nước cho phôi nảy mầm. Vì vậy, qua các giai đoạn nảy mầm, thể tích nước dừa trong quả giảm dần. GA3 20 mg/l kích thích mạnh sự nảy mầm nên thể tích nước dừa giảm nhiều hơn so với đối chứng với nước cất (bảng 3.7). Gibberellin đóng vai trò chủ đạo kích thích hạt nảy mầm ở cây Arabidopsis (Isabelle, 2000).
Đối với hạt có dầu, lipid dự trữ (các triacilglicerol) trong các lạp dầu bị thủy giải để tạo các acid béo. Lipid được đổi thành glucid trong phôi nhũ của các hạt và glucid được chuyển tới phôi đang tăng trưởng (Bùi Trang Việt, 2000). Quả dừa lưu trữ năng lượng dự trữ trong nội nhũ của hạt, chủ yếu là dầu có thành phần acid béo đặc trưng bởi sự phong phú của acid lauric và các chất này bị β- oxy hóa để tạo năng lượng (Arturo, 2000; Rossell, 1985). Do vậy, khi quả dừa nảy mầm, hàm lượng dầu giảm dần (bảng 3.9) do bị phân giải thành đường để cung cấp năng lượng cho phôi phát triển và hàm lượng đường tăng dần qua các giai đoạn ươm quả, đặc biệt với xử lí GA3 20 mg/l (bảng 3.8). Trong quá trình nảy mầm, gibberellin hoạt hóa các enzime thủy phân chất dự trữ như amylase, protease, … (Nguyễn Như Khanh, 2007).
Khi xử lí GA3, quả dừa nảy mầm mạnh nên cường độ hô hấp (bảng 3.11) và cường độ quang hợp (bảng 3.12) tăng cao. Nảy mầm là quá trình tiêu thụ nhiều năng lượng, nên trong quá trình nảy mầm, hạt thu nước và tăng cường độ hô hấp (Miller, 2000). Ngoại trừ một số loài, điều kiện kị khí ức chế sự nảy mầm, oxigen tuyệt đối cần thiết (Nguyễn Như Khanh, 2007).
Quả dừa khô (chín) lúc 12 tháng tuổi, khi vỏ hoàn toàn biến thành màu nâu, sẽ nảy mầm sau 4 – 6 tuần ươm giống. Phôi từ trong mắt lớn của hạt sẽ hình thành chồi mầm và rễ mầm, mộng choáng đầy gáo sau 6 tuần nảy mầm và quá trình nảy mầm vẫn tiếp tục trong 8 tuần (Edward và Craig, 2006). Trong quá trình nảy mầm của quả dừa, hoạt tính auxin, gibberellin và zeatin trong nước dừa tăng dần từ 0, 7 và 14 ngày sau khi ươm (bảng 3.10). Xử lí GA3 làm tăng hoạt tính auxin, gibberellin và zeatin và giảm hoạt tính acid abscisic so với đối chứng (nước cất) (bảng 3.11). Trong quá trình nảy mầm của hạt nói chung, lượng acid abscisic giảm, nhưng hoạt tính auxin, cytokinin và đặc biệt là gibberellin tăng đến trị số cao nhất (Nguyễn Như Khanh, 2007).
Ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên phôi dừa nảy mầm ngoài vườn ươm
Trong sự nảy mầm của phôi dừa, khi quả được xử lí GA3 20 mg/l, phôi cho chồi sớm và dài hơn so với các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác (ảnh 3.18 và bảng 3.3). Gibberellin kích thích sự tăng trưởng chồi và gỡ sự ngủ của chồi (Bùi Trang Việt, 2000; Buchanan, 2000; Davies, 2004). Trong hạt nảy mầm, acid abscisic đóng vai trò ngăn cản, citokinin có tác dụng loại bỏ tác động ức chế của acid abscisic, và gibberellin kích thích hạt nảy mầm (Nguyễn Như Khanh, 2007). Gibberellin cần thiết cho sự nảy mầm của hạt Arabidopsis và rau diếp (Pritchart, 2002). Gibberellin giúp hạt thoát khỏi trạng thái ngủ và thúc đẩy sự nảy mầm của các hạt giống ngủ (Koornneef, 2002; Leubner-Metzger, 2003).
Ở dừa, chiều dài chồi tăng dần theo nồng độ GA3 20, 50 và 100 mg/l (bảng 3.4, ảnh.3.24, 3.23 và 3.22). Tương tự, hạt cà chua được xử lí GA có tỷ lệ nảy mầm cao, thời gian nảy mầm giảm và cây mầm tăng trưởng mạnh, và GA3 900 mg/l có tác dụng tốt hơn (Balaguara, 2000). Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào, kích thích mạnh sự kéo dài tế bào trụ dưới lá mầm (Collett, 2000; Taiz và Zeiger, 2002). Vì thế, khi xử lí quả bằng dung dịch GA3 20 mg/l và NAA 2 mg/l (ảnh 3.24), chồi dừa dài hơn khi xử lí đơn lẻ GA3 20 mg/l (ảnh 3.25).
Nước dừa có chứa các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin (bảng 3.10), như kết quả của Jean năm 2009 và Wu năm 2009. Xử lí phối hợp nước dừa với GA3 (ảnh 3.28 và 3.32) giúp chồi dừa dài, to và xòe lá sớm hơn so với xử lí đơn lẻ GA3 (ảnh 3.27 và 3.31). Chồi ngắn hơn nếu chỉ xử lí nước dừa (ảnh 3.29 và 3.33), có lẽ do lượng gibberellin trong nước dừa thấp (bảng 3.5 và 3.10).
Chọn lọc nước dừa để dùng trong ươm quả và nuôi cấy phôi in vitro
Các thành phần được tìm thấy trong nước dừa bao gồm các loại đường, rượu đường, chất béo, acid amin, vitamin, các hợp chất đạm, acid hữu cơ, enzyme, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, đặc biệt là các loại cytokinin khác nhau như zeatin, N6-isopentenyladenine,… (Jean, 2009). Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, giúp hình thành và tăng trưởng lá (Bùi Trang Việt, 2000; Werner, 2001). Nước dừa Ta trong quả 7, 9 và 11 tháng tuổi giúp tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.)
tăng khối lượng so với nước cất, đặc biệt là nước dừa trong quả 11 tháng tuổi ở nồng độ 100% (bảng 3.2 và ảnh 3.15). Vì vậy, nước dừa ở giai đoạn quả 11 tháng tuổi được dùng xử lí trong ươm quả và nuôi cấy in vitro.
Môi trường nuôi cấy phôi dừa in vitro
Môi trường MS và Y3 trên cơ bản giống nhau, đều có bốn thành phần chính: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, hợp chất sắt và các vitamin. Tuy nhiên, môi trường Y3 chứa nhiều muối clorua hơn, và một số chất không có trong môi trường MS như khoáng vi lượng Ni, vitamin biotin, acid folic, Ca D pantothenate (bảng 1 và 2, phụ lục). Môi trường Y3 có đầy đủ các chất như nước dừa (Jean, 2009) nên giúp phôi dừa nảy mầm tốt (ảnh 3.38 và 3.39) so với môi trường MS (ảnh 3.34 và 3.35). Do đó, môi trường Y3 được sử dụng trong nuôi cấy phôi dừa.
Ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên phôi dừa nảy mầm in vitro
Gibberellin có thể phá bỏ sự ngủ của hạt, thúc đẩy sự vỡ của vỏ hạt và nội nhũ, tăng cường β-glucose trong nội nhũ và chống lại các hoạt động ức chế của acid abscisic trên hạt đang nảy mầm (Toyomasu, 1998 và Yamaguchi, 2001). Vì vậy,
phôi dừa nảy mầm rất nhanh trong các môi trường có bổ sung GA3 (bảng 3.14). Gibberellin kích thích sự kéo dài tế bào bởi cơ chế kiểm soát hướng đặt của các vi sợi. Nó cũng có tác dụng kéo dài lóng do sự phối hợp hoạt tính kéo dài và phân chia tế bào thân. Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu mô vỏ và biểu bì (Bùi Trang Việt, 2000; Davies, 2004). Do gibberellin có tác dụng kéo dài lóng rất mạnh nên khi nuôi cấy trong các môi trường có bổ sung GA3, phôi dừa tạo chồi rất dài nhưng nhỏ (bảng 3.14, 3.17 và ảnh 3.53, 3.54, 3.77, 3.78). Gibberellin có tác dụng cản sự ra rễ với nồng độ cao (Werner, 2001), vì thế trong môi trường bổ sung GA3 20 mg/l, phôi dừa không tạo được rễ (ảnh 3.54 và 3.78). Trong môi trường bổ sung GA3 20 mg/l và nước dừa 10%, phôi tạo chồi dài và rễ, do nước dừa có zeatin kích thích tăng trưởng chồi và auxin kích thích tạo rễ (bảng 3.14, 3.17 và ảnh 3.58, 3.79 và 3.83).
Cytokinin có vai trò thúc đẩy sự tăng trưởng của mô phân sinh ngọn chồi, nhưng ngăn chặn sự phân chia các tế bào trong rễ cây (Werner, 2001). Nồng độ cytokinin cao cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin (Humphries, 1960). Trong nuôi cấy mô, cytokinin được coi như chất ức chế sự hình thành rễ (Werner, 2001). Do vậy, trong nuôi cấy, phôi dừa tạo chồi, không tạo rễ trong môi trường bổ sung BA 10 mg/l (bảng 3.14 và ảnh 3.57).
Auxin cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào, có vai trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin kích thích sự tạo rễ (Võ Thị Bạch Mai, 2004; Taiz và Zeiger, 2002). Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thể non của rễ), nhưng ngăn cản sự tăng trưởng của các sơ khởi này (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Auxin ở nồng độ thấp kích thích sự phát triển rễ, nhưng có tác dụng ức chế sự phát triển rễ ở nồng độ cao (Rahman, 2001). Vì vậy, khi bổ sung AIA 2 mg/l vào môi trường nuôi cấy, phôi dừa tạo rễ ngắn và nhỏ (bảng 3.14 và ảnh 3.58).
Nước dừa có auxin, cytokinin, gibberellin. Vì vậy, khi bổ sung nước dừa 10% vào môi trường nuôi cấy, phôi dừa hình thành chồi và rễ khá tốt và lá xuất hiện sau 90 ngày nuôi cấy (bảng 3.15 và ảnh 3.62).
Ở quả dừa, hạt dự trữ năng lượng trong nội nhũ rắn (cơm dừa) và nội nhũ lỏng (nước dừa). Năng lượng dự trữ cần được tiêu hóa và vận chuyển đến mộng dừa để hạt nảy mầm (Arturo, 2000). Trong quá trình nảy mầm của quả dừa, mộng dừa lớn rất nhanh trong khoang chứa nước dừa. Mộng dừa (haustorium), được hình thành từ phần xa của phôi, chứa các hạt tinh bột, các giọt dầu, tích lũy nhiều năng lượng và chứa các enzyme phosphoglucomutase và phosphoglucose isomerase (Donald, 1996). Mộng dừa là cơ quan tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng (từ cơm dừa và nước dừa) và cung cấp chất dinh dưỡng cho phôi phát triển (Rossell, 1985). Trong nuôi cấy in vitro, phôi để nguyên trong mộng nảy mầm tốt, tạo chồi và rễ trong môi trường đối chứng (Y3) (ảnh 3.64) và môi trường có bổ sung GA3 5 mg/l (ảnh 3.65). Cytokinin ức chế sự tạo rễ. Vì thế, phôi tạo chồi nhưng không tạo rễ trong môi trường Y3 bổ sung BA 10 mg/l (ảnh 3.66). Gibberellin và cytokinin tăng trong quá trình nảy mầm của hạt Cucurbita pepo L. (Pinfield, 1984). Cytokinin giúp sự tái lập tăng trưởng của chồi ngủ, kích hoạt hoạt động của mô phân sinh ngọn, trong khi gibberellin kích thích tăng trưởng chồi ở củ khoai tây (Anja, 2011). Phôi cô lập không được cung cấp cytokinin từ mộng, nên không nảy mầm trên môi trường có bổ sung GA3 5 mg/l, và chỉ tạo chồi rất nhỏ và yếu trên môi trường với BA 10 mg/l (ảnh 3.69).
Tóm lại, phôi dừa in vitro nảy mầm tốt trên môi trường Y3 bổ sung nước dừa 10%, hay phối hợp GA3 20 mg/l và nước dừa 10%. Phôi giữ nguyên trong mộng tạo chồi và rễ trong nuôi cấy. Phôi cô lập nảy mầm rất kém.
KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Kết luận
Trong quá trình nảy mầm của phôi dừa, thể tích nước dừa giảm, hàm lượng đường trong nước dừa tăng, hàm lượng dầu trong cơm dừa giảm, hoạt tính auxin, cytokinin, gibberellin tăng qua các giai đoạn ươm quả.
Khi xử lí GA3, phôi dừa tạo chồi có cường độ hô hấp và cường độ quang hợp tăng, hoạt tính auxin, cytokinin, gibberellin trong chồi tăng.
Nước dừa ở giai đoạn quả 11 tháng tuổi thích hợp cho ươm giống và nuôi cấy in vitro.
Trong ươm quả, trong số các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được xử lí, GA3 giúp phôi dừa nảy mầm mạnh nhất. Nồng độ GA3 càng cao, phôi dừa nảy mầm càng mạnh. Xử lí phối hợp GA3 và nước dừa, phôi dừa nảy mầm tốt hơn khi xử lí đơn lẻ GA3.
Trong nuôi cấy in vitro, phôi dừa không nảy mầm trên môi trường MS, nảy mầm tốt trên môi trường Y3 nhất là khi được bổ sung nước dừa 10%, hay phối hợp GA3 20 mg/l và nước dừa 10%. Phôi giữ nguyên trong mộng tạo chồi và rễ, nhưng phôi cô lập nảy mầm rất kém.
Đề nghị
Trong thời gian tới, nếu có điều kiện, chúng tôi sẽ:
Cải tiến các dung dịch xử lí khi ươm giống và nuôi cấy in vitro để đạt hiệu quả cao hơn.
Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát triển cây mầm dừa (Cocos nucifera L.).
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Phạm Hoàng Hộ (1999). Cây cỏ Việt Nam, quyển 3. NXB Trẻ.
2. Dương Công Kiên (2002). Nuôi cấy mô thực vật. NXB Giáo dục.
3. Nguyễn Như Khanh (2007). Sinh học phát triển thực vật. NXB Giáo dục.
4. VõVăn Long (chủ biên), Ngô Thị Lam Giang, Nguyễn Thị Lệ Thủy, Nguyễn Thị Bích Hồng, Phạm Thị Lan và Nguyễn Trung Phong (2008). Sổ tay cây dừa. NXB Nông nghiệp.
5. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002). Công nghệ tế bào. NXB Đại
học quốc gia Tp.HCM.
6. Võ Thị Bạch Mai (2004). Sự phát triển chồi và rễ. NXB Đại học Quốc gia
Tp.HCM.
7. Nguyễn Thị Lệ Thủy (2009). Đặc điểm sinh học cây dừa. Sở khoa học công nghệ Bến Tre.
8. Mai Trần Ngọc Tiếng, Nguyễn Thị Ngọc Lang, Đặng Vĩnh Thanh, Nguyễn Du Sanh, Bùi Trang Việt (1980). “Kích thích tố giâm cành. Phần 2: Cơ chế tạo rễ bất định”. Thông báo khoa học. Đại học Tổng hợp Tp. HCM, 4, 93-98. 9. Mai Trần Ngọc Tiếng (2001). Thực vật cấp cao. NXB Đại học Quốc gia
Tp.HCM.
10. Bùi Trang Việt (2000). Sinh lí thực vật đại cương. Phần II – Phát triển. NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM.
11. Bùi Trang Việt (2003). Sinh phôi thể hệ ở thực vật. Giáo trình cao học sinh lí
thực vật.
12. Vũ Văn Vụ (1999). Sinh lí thực vật ứng dụng. NXB Giáo dục.
13. Vũ Văn Vụ (chủ biên), Vũ Thành Tâm và Hoàng Minh Tấn (2008). Sinh lí
Tài liệu tiếng Anh
14. Anja H., Melanie S., Peter H., Uwe S., and Sophia S. (2011), “Reactivation of meristem activity and sprout growth in Potato tubers require both cytokinin and gibberellin”, Plant Physiolog 155, 776-797.
15. Arturo L.V., Peter F.D., and Roland H. (2000), “Changes in phytohormone composition during development of tissues of coconut (Cocos
nucifera L.) embryos in the intact nut and in vitro”, Journal. Experimental Botany 52, 933-942.
16. Balaguera H.E., Cardenas J.F., and Herrera J.G. (2000), “Effect of gibberellic acid (GA3) on seed germination and growth of Tomato (Solanum
lycopersicum L.)”, ISHS Acta Horticulturae 821.
17. Bo Hu, Xiao-rong Wan, Xiao-hui Liu, Dong-liang Guo and Ling Li (2010),
“Abscisic acid (ABA)-mediated inhibition of seed germination involves a positive feedback regulation of ABA biosynthesis in Arachis hypogaea L.”,
African Journal of Biotechnology 9, 1578-1586.
18. Chen C.M., Jin G., Anderson B.R., and Etral J. (1993), “Modulation of plant gene expression by cytokinin”, Plant physiol 20, 609 - 619.
19. Collett C.E., Harberd N.P., and Leyser O. (2000), “Hormonal interactions in the control of Arabidopsis hypocotyl elongation”, Plant Physiology 124, 553– 561.
20. Chory J., Reinecke D., Sim S.,Wasbburn T., and Brener M. (1994), “A role for cytokinin in de-etiolation in Arabidopsis”, Plant physiol 104, 339-347. 21. Chrispeels M., and Varner J. (1966), “Inhibition of gibberellic acid induced
formation of alpha-amylase” by abscisin II, Nature 212, 1066-1067
22. Crowell D.N., and Amasino R. M. (1994), “Cytokinin and plant gene regulation”, Chemistry, Activity and Function, CRC Press, Boca Raton, FL, 233-242.
23. Davies P.J. (2004), Plant Hormones: Biosynthesis, Signal Transduction, Action!, Kluwer Academic: Dordrecht, The Netherlands.
24. Debeaujon I., and Koornneef M. (2000), “Gibberellin requirement for
Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid”, Plant Physiology 122, 415-424.
25. Donald P.W. (1996), “Coconut palm from seed”, CTAHR Department of Horticulture; originally published as Hawaii Cooperative Extension, Service
Instant Information, 5.
26. Edward C. and Craig R.E. (2006), “Cocos nucifera (coconut)”, Species Profiles for Pacific Island Agroforestry, 21.
27. Edwin F.G. (1996), “Plant propagation by tissue culture”, Part 2: In practice.
Exegetics Limited, 613 – 936.
28. Evelyn P.P.,and Bienvenido O.J. (1972), “Biochemical Changes in the Rice Grain during Germination”, Plant Physiol 49, 751-756.
29. Gazzarrini S., and McCourt P. (2003), Cross-talk in plant hormone signalling: what Arabidopsis mutants are telling us. Annals of Botany 91, 605–612.
30. Graham I.A. (2008), “Seed Storage Oil Mobilization”, Annual Review of Plant
Biology 59, 115-142.
31. Gutierrez L., Bussell J.D., Pacurar D.I., Schwambach J., Pacurar M., and Bellini C. (2009), “Phenotypic plasticity. Of adventisous rooting in Arabidopsis controlled by complex regulation of auxin response factor transcript and micro RNA abundance”, The Plant Cell 21, 3119-3132.
32. Humphries E.C. (1960), “Inhibition of root development on petioles and hypocotyl of dwarf bean (phaseolus vulgaris) by citokinin”, Physiol Plantarum