Lát cắt dọc qua mô phân sinh ngọn chồi quả dừa Ta 0 ngày, 7 ngày và 14 ngày sau khi ươm tự nhiên và nuôi cấy in vitro trong môi trường Y3, được nhuộm hai màu đỏ carmine - xanh iod và quan sát dưới kính hiển vi quang học.
Sử dụng máy cắt microtome giải phẫu phôi
Phôi dừa Ta ở ba giai đoạn 0, 7 và 14 ngày sau khi nuôi cấy in vitro được cắt dọc bằng microtome qua các bước:
1. Cố định mẫu
Phôi dừa sau khi lấy ra từ trái được cố định ngay trong môi trường FAA (formadehid acol acid) (phụ lục). Sau 24 giờ, chuyển mẫu vào etanol 700.
2. Đúc mẫu
Loại nước bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 700: 3 lần, mỗi lần 20 phút. - Etanol 950: 3 lần, mỗi lần 20 phút. - Etanol 1000: 3 lần, mỗi lần 20 phút.
Loại etanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Butanol 1: 30 phút.
- Butanol 2: 30 phút. - Butanol 3: 60 phút.
- Butanol 4: 10 giờ hoặc qua đêm.
Loại butanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong paraffin tan ở 560 – 600C: - Paraffin 1: 1 giờ.
- Paraffin 2: 1 giờ. - Paraffin 3: 1 giờ.
Đổ paraffin nóng chảy vào khuôn, đặt mẫu vào và đổ đầy paraffin. 3. Cắt và dán mẫu
Mẫu được cắt dọc thành từng lát mỏng 5μm nhờ máy vi phẫu (microtome). Băng paraffin có chứa mẫu được cắt thành từng đoạn ngắn và được dán lên lam chứa dung dịch gelatin 1%. Đặt mẫu trên bếp ở nhiệt độ khoảng 350C. Mẫu dãn ra dán chặt vào lam. Giữ mẫu trong tủ ấm ở 300C trong hai ngày để cho mẫu thật khô.
4. Nhuộm mẫu
Loại paraffin bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Méthylcyclohexan 1: 10 phút.
- Methylcyclohexan 2: 10 phút.
Rửa mẫu bằng etanol 1000. Sau đó, đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 1000: 5 phút.
- Etanol 950: 5 phút. - Etanol 700: 5 phút. - Nước cất: 5 phút.
Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmine-xanh iod và quan sát dưới kính hiển vi quang học.