2. Mục đích nghiên cứu
3.2. Phạm vi nghiên cứu
Về thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2008 đến tháng 9/2009. Về không gian: Đề tài nghiên cứu giới hạn trong phạm vi là xã Cảnh Hưng huyện Tiên Du tỉnh Bắc Ninh với mục đích đánh giá thực trạng và tiềm năng thức ăn tự nhiên, các loài cây trồng phục vụ cho chăn nuôi đại gia súc.
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã dùng các phương pháp sau:
3.3.1. Các phương pháp nghiên cứu ngoài thiên nhiên
3.3.1.1. Nghiên cứu tại Cảnh Hưng (mô hình bò sữa)
- Tìm hiểu các đặc điểm sinh thái ở xã Cảnh Hưng Tiên Du - Bắc Ninh, tình hình khai thác thức ăn của các hộ gia đình của xã.
- Trực tiếp quan sát ngoài đồng cỏ hộ nông dân nông dân, lấy mẫu vật về phân tích.
- Chọn 3 loài cỏ trồng được dùng làm thức ăn cho gia súc của một số hộ gia đình. Xác lập ô nghiên cứu với diện tích 80m2 x 2/loài. Mỗi ô được bố trí sao cho có sự đồng đều về địa hình, đất đai, sự chăm bón. Trong các ô tiến hành bón phân theo công thức, sau đó xác định số lứa cắt và năng suất từng lứa.
- Chọn 2 hộ thuộc hai mô hình khai thác khác nhau để nghiên cứu và so sánh hiệu quả kinh tế.
- Mẫu cỏ, đất điều tra ngoài thiên nhiên theo phương pháp Hoàng Chung (2008).
- Điều tra các nguyên nhân ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng cỏ. - Điều tra qui trình thức ăn 1 năm của một số gia đình, mô hình chăn nuôi.
3.3.1.2. Nghiên cứu tại Hiệp Hoà (mô hình bò thịt)
Dùng phương pháp ô tiêu chuẩn của Hoàng Chung (2008).
3.3.2. Các phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
Mẫu thực vật thu được đem về giám định tên khoa học và phân tích trong phòng thí nghiệm.
Xác định tên khoa học của các loài cây thức ăn gia súc:
Chúng tôi sử dụng khoá phân loại hiện hành của các tác giả Nguyễn Tiến Bân và cộng sự (2001, 2003, 2005) [4], Lê Khả Kế (1969, 1975) [15], Phạm Hoàng Hộ (1993) [12] và một số tài liệu liên quan đến phân loại.
Nghiên cứu năng suất :
Theo phương pháp của Hoàng Chung (2006. Mẫu mang về phòng thí nghiệm được phân thành 2 phần : Phần tươi và phần chết. Phần tươi được phân chia theo các nhóm: Hoà thảo, Xa thảo, cây Họ đậu, cây Thuộc thảo, cây gỗ + cây bụi theo các phần : Lá, thân, hoa….sau đó cân tươi rồi sấy khô, cân khô và tính giá trị trung bình. Phần đã chết và phần chưa hoàn toàn mục nằm trên mặt đất đều thuộc phần chết chung.
Đánh giá chất lượng cỏ:
Chúng tôi phân tích 2 giống cỏ trồng điển hình tại Cảnh Hưng, mỗi giống ở 3 địa điểm khác nhau với các chỉ tiêu nước, vật chất khô, prôtêin, đường và chất xơ, lipid.
Đánh giá chất lượng đất trồng: Chọn 11 mẫu đất trồng để phân tích các
chỉ tiêu: VCK, pH, Nitơ, P2O5. K2O, OM .
a. Xác định lượng vật chất khô trong cỏ [21]:
Sấy mẫu ở nhiệt độ 1050 C đến khi khối lượng mẫu không đổi và xác định sự thay đổi khối lượng trong quá trình sấy.
- Dụng cụ:
+ Cân phân tích với độ chính xác đến ± 0,0001 gam. + Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ ± 10
C.
+ Hộp nhôm + nắp có đường kính 65 mm, cao 30 mm. + Bình hút ẩm có chứa chất hút ẩm.
- Các bước tiến hành:
Sấy hộp nhôm và nắp ở nhiệt độ 1050 C trong vòng 30 phút, sau đó để nguội trong bình hút ẩm cân chính xác đến 0,0001 g.
Cân vào hộp nhôm 5g mẫu ở trạng thái khô không khí với độ chính xác 0,0001g. Mở nắp hộp nhôm, đặt nắp xuống đáy của hộp sau đó cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 1050
C (± 10C) trong vòng 4 giờ tính từ khi nhiệt độ của tủ sấy đạt 1050
C (Chú ý: thời gian để đạt nhiệt độ 1050 C tính từ lúc bắt đầu cho hộp nhôm vào sấy không vượt quá 30 phút). Sau khi sấy 4 giờ, chúng ta đậy nắp hộp nhôm lại sau đó lấy ra cho vào bình hút ẩm. Sau khi để nguội đem cân bằng cân phân tích. Khối lượng hao hụt sau khi sấy được coi là lượng nước, phần còn lại sau khi sấy kiệt gọi là lượng vật chất khô.
- Tính toán lượng vật chất khô trong mẫu phân tích (S): Được tính theo công thức phần trăm (%):
m m x
S 100 1 (3.1)
Trong đó: S là lượng vật chất khô trong mẫu (%). m1 là khối lượng mẫu sau khi sấy ở 1050C.
m là khối lượng mẫu trước khi sấy ở 1050
C.
b. Xác định hàm lượng nước trong cỏ:
100 x W B A X (3.2)
Hàm lượng nước = 100% (tươi)- vật chất khô (%)
A : Là trọng lượng bình + trọng lượng mẫu ban đầu trước khi sấy B : Trọng lượng bình + trọng lượng mẫu
c. Phương pháp phân tích hàm lượng chất xơ theo Heenerberg-Stohmann
[22]:
Chất xơ được coi là tổng hợp của nhiều chất như xenluloze, hemixenluloze, các chất pectin, lignin. Việc định nghĩa chất xơ không dễ dàng, mà thường được coi là các chất còn lại sau quá trình thuỷ phân.
Chất xơ thô là phần còn lại của các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật sau quá trình thuỷ phân bằng Axít sunfuric và dung dịch Natrihiđroxit.
Chất xơ thực phẩm là phần còn lại của các tế bào thực vật được phân huỷ bằng các men tiết ra từ các tuyến tiêu hoá. Đó là hỗn hợp xenluloze, hemixenluloze và lignin.
Việc phân tích chất xơ là một phương pháp cổ điển nhưng luôn luôn là vấn đề cần được thảo luận thấu đáo. Do quá trình thuỷ phân hoá học các chất trong mẫu phân tích luôn luôn cần một môi trường càng chính xác bao nhiêu càng cho kết quả chính xác bấy nhiêu.
Từ quan điểm trên việc phân tích chất xơ có thể được tiến hành theo hai cách: Phương pháp hoá học và phương pháp sử dụng enzim. Trong đó, phương pháp phân tích hoá học dùng để phân tích chất xơ là một trong những phương pháp cổ điển nhất của phương pháp phân tích thành phần hoá học có trong thức ăn. Bản chất của phương pháp này xuất phát từ qúa trình thuỷ phân các chất của tế bào thực vật.
- Hoá chất:
+ Dung dịch Axít sunfuric (H2SO4) 0,255 ± 0,005 N. + Dung dịch Natrihiđroxit (NaOH) 0,313 ± 0,005 N. + Acetone.
- Thiết bị:
+ Thiết bị phân tích xơ ANKOM 200/220.
+ Túi lọc: Sử dụng túi lọc ANKOM F57 hoặc F58.
+ Dụng cụ hàn miệng túi: yêu cầu có nhiệt độ cao đủ để làm chảy nhựa polime trong túi lọc (số hiệu # 1915 hoặc 1920).
+ Tủ sấy
- Các bước tiến hành:
+ Đánh dấu túi lọc bằng bút không bị xoá trong dung môi. Cân túi lọc (ghi W1.1) sau đó chỉnh cân về không (ấn phím TARE).
+ Túi đối chứng: Cân ít nhất 1 túi không và cho vào cùng phân tích (ghi W1.2), điều này cho phép xác định sai số xảy ra đối với độ ẩm và khối lượng của túi.
+ Cân khoảng 1g mẫu cho thẳng vào túi lọc (ghi W2). Mẫu cân phải cho sát đáy túi.
+ Hàn miệng túi trong khoảng 4 mm tính từ miệng túi bằng dụng cụ hàn túi. Dàn đều mẫu trong túi bằng lắc hoặc gõ túi. Tránh không để mẫu gần phần hàn miệng túi (trong phạm vi 4 mm).
+ Đặt tối đa 24 túi vào khay chứa túi của máy ANKOM. Sử dụng tất cả chín khay mà không quan tâm đến số túi phân tích. Đặt 3 túi vào một khay và xếp các khay vào trục đứng, mỗi cái lệch nhau một góc là 1200. Đặt cả trục chứa các khay mẫu vào buồng phân tích, đặt khối sắt hình trụ lên khay thứ 9 không chứa mẫu để dìm toàn bộ khay xuống.
+ Khi phân tích 24 túi lọc, đổ vào đó 1.900 – 2.000 ml dung dịch axit có nhiệt độ ổn định cho đến khi ngập túi lọc. Nếu phân tích ít hơn 20 túi, cho theo tỉ lệ 100ml axit/ 1 túi (tối thiểu phải có 1.500 ml).
+ Công phá 40 phút bằng dung dịch Axít sunfuric (H2SO4) 0,255 ± 0,005N, sau đó rửa nước cất 2 lần (mỗi lần 5 phút).
+ Công phá 40 phút bằng dung dịch Natrihiđroxit (NaOH) 0,313 ± 0,005 N, sau đó rửa bằng nước cất tất cả 3 lần.
+ Tháo túi lọc khỏi khay, bóp nhẹ cho bớt nước thừa. Cho túi vào cốc thuỷ tinh thể tích 250 ml, cho thêm acetone ngập túi. Ngâm khoảng 3 – 5 phút, lấy túi mẫu ra, nhẹ nhàng bóp để rút bớt acetone.
+ Trải đều túi lọc để khô không khí. Cho vào tủ sấy đặt nhiệt độ 1050
C, sấy trong vòng 2 – 4 giờ.
(Chú ý: Không cho túi lọc vào tủ sấy trước khi acetone khô hết).
+ Sau khi sấy khô, lấy túi lọc ra cho vào bình hút ẩm. Để nguội và cân (ghi W3). Tính lượng xơ và khoáng của mẫu bằng công thức W4:
W4 = W3 – W1.1
+ Đưa cả túi đối chứng và túi chứa mẫu vào đốt trong lò nung ở nhiệt độ 5500C trong vòng 2 giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân (ghi W5.1 là khối lượng chén + khoáng của mẫu, W5.2 là khối lượng chén + bao đối chứng sau đốt).
Tính lượng khoáng thực sự của mẫu như sau: W5 = (W5.1 – WCM) – W5.2 – WCĐC)
Trong đó WCM là khối lượng chén dùng đốt mẫu. WCĐC là khối lượng chén dùng đốt bao đối chứng. - Tính toán kết quả:
Hàm lượng xơ thô tính bằng % theo công thức sau:
100 2 5 4 x W W W X (3.3) Trong đó:
X: Hàm lượng xơ thô (%)
W2: Khối lượng mẫu phân tích tính bằng gam
W4: Khối lượng chất xơ + khoáng sau khi lọc ete, axit, bazơ và acetone. W5: Khối lượng tro của chất xơ sau khi nung
d. Phương pháp phân tích hàm lượng Protein thô theo phương pháp MicroKjeldanl [6]:
- Nguyên lý:
Trong phương pháp MicroKeldan người ta vô cơ hoá mẫu bằng H2SO4
98% kết hợp với chất xúc tác để chuyển nitơ hữu cơ ra dạng (NH4)2SO4, rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối Amoni, NH3 sau khi được giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nước nóng. Sau khi được làm nguội sẽ được hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có màu xanh trong.
(NH4)2SO4 + 2NaOH = 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O 3NH3 + H3BO4 = (NH4)3BO3
Để xác định được lượng amoniac giải phóng ra trong quá trình chưng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang mầu tím nhạt là được.
2(NH4)3BO3 + 3H2SO4 → 3(NH4)2SO4 + 2 H3BO3
Từ lượng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính được lượng nitơ có trong mẫu.
- Dụng cụ: Ống công phá mẫu; Bình tam giác 300 ml
- Hoá chất: H2SO4 đậm đặc 98%; Viên xúc tác Kjeldahl (hỗn hợp Cu và Se); H2SO4 0,1N; NaOH 33%; H3BO3 4% cùng với chất chỉ thị màu Tashio (gồm hỗn hợp xanh Methylen và đỏ Methylen); Nước cất.
- Cách tiến hành:
Giai đoạn công phá mẫu: + Bước 1: Cân mẫu:
Mẫu được xấy khô ở nhiệt độ 50 – 600C, sau đó nghiền nhỏ.
Tiến hành: Cân chính xác và cẩn thận bằng cân phân tích (có độ chính xác 0,0001) 1-1,5 g mẫu cho vào bình công phá (trước khi cho mẫu đã cân
vào ống thì ta phải cho vào ống 1 viên xúc tác trước), sau đó cho vào 10 ml H2SO4 đậm đặc, bịt chặt ống đốt mẫu bằng giấy thiếc và ngâm qua đêm.
Chú ý: Để tăng độ chính xác khi phân tích, chúng ta phải bố trí 1 ống
Kjeldahl đối chứng chỉ có chất xúc tác và 10 ml H2SO4 đậm đặc mà không có mẫu phân tích, tiến hành tất cả các bước như mẫu phân tích thật.
+ Bước 2: Công phá mẫu:
Nhiệt độ cần cho quá trình công phá là 3800C, thời gian công phá là 40 phút. Khi quá trình công phá đã được ta đợi nhiệt độ của ống Kjeldahl hạ xuống bằng nhiệt độ môi trường rồi đưa vào chưng cất.
Giai đoạn chưng cất và phân tách amoniac sau khi công phá:
Sau khi công phá xong ta tiến hành chưng cất trên máy cất đạm tự động Gerhardt. Máy tự động hút dung dịch NaOH, H3BO3 và nước cất. Thời gian chưng cất là 5 phút (chú ý khi chạy máy phải đủ lượng nước làm lạnh), dung dịch sau chưng cất có mầu xanh.
Giai đoạn xác định lượng amoniac giải phóng ra sau quá trình chưng cất: Để xác định được lượng amoniac giải phóng ra trong quá trình chưng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang mầu tím nhạt là được, từ lượng axits H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính được lượng đạm có trong mẫu.
- Tính kết quả: Dựa trên lượng axit sunphuaric 0,1N tính ra hàm lượng prôtein có trong mẫu.
e. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Bertrand [6]:
- Nguyên tắc:
Đường khử do trong cấu trúc có nhóm aldehit có tính khử mạnh nên có khả năng tham gia phản ứng tráng bạc và phản ứng với dung dịch Fehling.
R – CHO + 2AgNO3 + 3NH3 + H2O → R – COONH4 + 2NH4NO3 + 2Ag ↓ R – CHO + 2 Cu(OH)2 → R- COOH + Cu2O ↓ + 2H2O.
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 → 2CuSO4 +2 FeSO4 + H2O
10 FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 5 Fe2(SO4)3 + 8H2O. Khi dùng dung dịch chuẩn KMnO4 0,1N để chuẩn độ lượng FeSO4 tạo thành, từ thể tích tiêu tốn khi tra bảng sẽ tìm được số mg đường khử và áp dụng công thức ta sẽ tìm được hàm lượng đường hay tinh bột trong mẫu.
- Cách tiến hành:
Công đoạn chiết, tách và thuỷ phân:
Cân một lượng mẫu cỏ sao cho khi pha xong có hàm lượng từ 4 – 10% đường. Mẫu cỏ được cắt nhỏ rồi nghiền mịn, sau đó thêm vào khoảng 50 ml nước, đun cách thuỷ ở 800C trong 15 phút, để nguội khử tạp chất rồi định mức đến thể tích cần chiết (100 – 150 ml) cả bã, lọc lấy dịch trong. Dung dịch này chỉ phân tích được hàm lượng đường khử (monosaccarit).
Tiến hành phân tích:
Lấy 10ml dung dịch Fehling A và 10 ml dung dịch Fehling B cho vào cốc có dung tích 250cc, đun sôi, thêm 10ml dung dịch phân tích và khoảng 20ml nước sôi. Dung dịch phía trên phải có màu xanh, nếu không phải làm lại với lượng dịch lọc ít hơn. Nhưng tổng thể tích dung dịch cuối cùng trong cốc phải bằng 50ml. Sau lọc kết tủa qua phễu, giữ kết tủa trong cốc, tráng bằng nước cất sôi một vài lần, sao cho hết màu xanh trên phễu lọc, hoà tan tủa trong cốc bằng 30ml dung dịch Fe2(SO4)3. Lấy bình hứng ra và chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0,1N, đến khi xuất hiện màu hồng.
Hàm lượng đường khử được tính theo công thức:
1000 . 10 100 . . A G V X (3.4)
Trong đó:
X là hàm lượng đường khử có trong mẫu (%). V: thể tích dung dịch pha ban đầu
G: mg glucoza A: số gam mẫu cân
10: số ml dung dịch đem phân tích. 1000: hệ số chuyển đổi mg sang gam
f. Xác định hàm lượng lipit:
[6] Dựa vào tính chất hòa tan của lipit trong dung môi hữu cở để chiết lipit, dung môi được sử dụng là petroleum ether .
Cỏ nghiền mịn , sấy đến khô tuyệt đối . Cân 0,05g mẫu cho vào eppendorf, thêm 1,5 ml petroleum ether lắc đều bằng voltex 10 phút, để qua đêm ở nhiệt độ 40C. Sau đó ly tâm 12000 vòng/ phút ở 40
C trong 15 phút, bỏ dịch. Tiến hành lặp lại 3 lần. Sấy khô mẫu đến khối lượng không đổi .
Hàm lượng lipit được tính theo công thức sau :
Hàm lượng lipit (%) = A B A
100 %
Trong đó: A : khối lượng mẫu trước khi chiết (mg)
B : Khối lượng mẫu sau khi chiết chiết (mg)1000: hệ số chuyển đổi mg sang gam.
3.3.2.5. Phương pháp phân tích đối với mẫu đất :
Trên vị trí nghiên cứu chúng tôi lấy mẫu đất tại ô tiêu chuẩn và các điểm ngoài ô tiêu chuẩn. Mẫu đất lấy ở độ sâu : 0- 20cm và đem phân tích tại phòng phân tích đất Khoa nông học - Trường đại học Nông Lâm- đại học Thái Nguyên theo phương pháp của Lê Văn Khoa và Lê Văn Tiềm [18], [19].
- Xác định độ ẩm của đất theo phương pháp sấy khô tuyệt đối : Cân 100 gam đất đã hong khô không khí và rây qua rây 1mm cho vào hộp nhôm (mở
nắp)sấy trong tủ ở 105oC đến trạng thái không đổi trong thời gian 12 giờ, tiến