Sự tổng hợp protein phụ thuộc rất nhiều yếu tố cho nên việc xác định được điều kiện tối ưu cho tổng hợp protein quan tâm là điều quan trọng. Để xác định được điều kiện tối ưu đó chúng tôi tiến hành thử biểu hiện gen ở các điều kiện nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng khác nhau.
Kết quả tối ưu nhiệt độ cảm ứng
Thông thường, nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn E. coli là ở 37oC. Tuy nhiên, đối với protein tái tổ hợp thường bị ức chế bởi các protein vật chủ, hoặc bị phân hủy bởi nhiệt độ cao hoặc gây độc với tế bào vật chủ .v.v thì nhiệt độ này trong nhiều trường hợp là không phù hợp. Về mặt lý thuyết, điều này được
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
giải thích là khi sinh trưởng ở nhiệt độ tối ưu protein tái tổ hợp do được điều khiển bởi promoter mạnh như T7 promoter sẽ được tổng hợp ồ ạt một lượng rất lớn trong một thời gian ngắn. Trong khi đó, các protein chức năng khác tham gia vào quá trình tạo cấu trúc protein bậc cao hơn lại không được tổng hợp với tốc độ tương ứng, do đó ảnh hưởng đến cấu trúc thứ cấp của protein tái tổ hợp và thông thường làm cho protein được tổng hợp dưới dạng không tan, có hoạt tính thấp hoặc thậm chí mất hoạt tính. Thêm vào đó 37oC là nhiệt độ tối thích cho các protease nội bào hoạt động, do đó các protein ngoại lai sẽ bị phân cắt sau khi tổng hợp, ảnh hưởng đến hiệu suất biểu hiện và chất lượng protein [1].
Để thu protein SEB với lượng lớn có hoạt tính mà không lẫn quá nhiều protein của bản thân E.coli, tăng hiệu quả quá trình tinh sạch protein sau này, chúng tôi quyết định tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein SEB tái tổ hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 28oC và 37oC với cùng nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM và thời gian cảm ứng 3 giờ. Sau 3 giờ nuôi cảm ứng tế bào được thu lại để kiểm tra mức độ biểu hiện và tính chất của protein tái tổ hợp. Dịch chiết và phần cặn tế bào được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12%. Kết quả trình bày trên hình 3.13.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.13. Điện di so sánh khả năng biểu hiện protein SEB ở các nhiệt độ khác nhau. M: Thang protein chuẩn; 2: Không cảm ứng ở 37oC; 3: Cảm ứng ở 37oC, dịch; 4: Cảm ứng biểu hiện ở 37o
C, cặn; 5: Cảm ứng ở 28oC C, cặn; 6: Cảm ứng ở 28oC C, dịch; 7: Không cảm ứng ở 28oC.
Kết quả thu được trên hình 3.13 cho thấy ở đường chạy của giếng số 5 xuất hiện băng protein SEB đậm hơn hẳn băng protein ở giếng số 2. Chứng tỏ protein SEB tái tổ hợp trong điều kiện 28oC tan tốt hơn so với điều kiện nhiệt độ 37oC. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ cảm ứng là 28oC cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng trên gen seb
Protein ngoại lai được điều khiển tổng hợp bởi promoter T7 trên vector pET21a+. Promoter này được cảm ứng bởi sự có mặt của IPTG trong môi trường nuôi cấy. Nồng độ chất này ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện protein ngoại lai của tế bào. Ở nồng độ quá cao nó gây độc cho tế bào, trong khi ở nồng độ quá thấp protein ngoại lai thường được tổng hợp kém [1]. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng biểu hiện protein SEB tái tổ hợp ở các nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau từ 0,4 - 1 mM (0,4 mM; 0,6 mM; 0,8 mM và 1 mM) ở 28oC và thu mẫu sau 3 giờ cảm ứng. Kết quả thí nghiệm được thể hiện tổng quát qua hình 3.14. Theo đó, lượng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
protein SEB tái tổ hợp được tổng hợp nhiều nhất tương ứng với nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM cho nghiên cứu tiếp theo.
Thời gian cảm ứng cũng có liên quan chặt chẽ đến số lượng và chất lượng của protein tái tổ hợp được biểu hiện. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát các thời điểm thu mẫu khác nhau từ 1 giờ đến 5 giờ sau khi bổ sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1 mM và nuôi cấy ở 28o
C. Protein tổng số ở các giai đoạn được kiểm tra trên gel điện di polyacrylamide 12% và kết quả thí nghiệm được thống kê trong hình 3.14. Sau 5 giờ cảm ứng, protein SEB tái tổ hợp biểu hiện được là một băng đậm, rõ nét hơn so với băng thu được ở các thời điểm khác. Từ kết quả này, chúng tôi lựa chọn khoảng thời gian cảm ứng là 5 giờ cho các quá trình tổng hợp protein SEB.
Hình 3.14. So sánh khả năng biểu hiện SEB tại các điều kiện khác nhau Như vậy, điều kiện tối ưu để cảm ứng biểu hiện protein SEB trong chủng biểu hiện BL21(DE3) là ở nhiệt độ 28o
C, nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM sau 5 giờ cảm ứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn