Protein là thành phần quan trọng của cả hạt và rễ cây trồng. Chúng là thành phần chức năng và cấu trúc cơ bản của thành tế bào cây và chiếm 1/3 nitơ tổng số trong đất. Protein cung cấp cho đất lấy từ tất cả xác các sinh vật, động thực vật. Protein trong đất được phân huỷ nhanh chóng nhờ nhiều loại vi khuẩn và nấm. Trong quá trình phân giải, proteaza ngoại bào thực hiện việc cắt đứt các liên kết peptit để tạo ra các polypeptit và oligopeptit, kết quả là sau đó giải phóng ra các hợp chất có phân tử lượng thấp và được tích luỹ bởi VSV. Nhờ vào proteaza được giải phóng từ các tế bào VSV, các enzym trong đất này được hấp thụ vào các keo đất hoặc gắn hoá trị vào vật chất hữu cơ đất. Các enzym cố định này chỉ rõ khả năng đề kháng cao đối với sự phân giải protein. Ngược lại, proteaza bị ức chế bởi sự làm khô.
Nhiều phương pháp đã được sử dụng để phân tích hoạt động của proteaza, ureaza, amidaza,… ở trong đất. Mặc dù nhiều loại enzym tham gia vào trao đổi nitơ đã được xác định, vẫn có ít thông tin về nitrat reductaza. Trong điều kiện yếm khí, nitrat được biến đổi thành NO2-, N2O, N2. Trong quá trình phản nitrat hoá, men dị hoá nitrat reductaza xúc tác giai đoạn đầu tiên biến đổi NO3- thành NO2- trong điều kiện yếm khí. Nghiên cứu của Cooper và Smith (1963) đã chỉ rõ rằng tỉ lệ giới hạn quá trình phản nitrat hoá trong đất axit là sự biến đổi NO3-, trong đất kiềm là sự biến đôỉ NO2-. Trong bài tập này, một phương pháp chính xác, đơn giản và nhạy được sử dụng để xác định nitrat reductaza trong đất (theo Abdelmagid và Tabatabai).
Dùng KNO3 là chất nền, mẫu đất được nuôi ở 25oC trong 24h dưới điều
kiện ẩm trong ống nghiệm. Nitrit reductaza bị ức chế do thêm vào 2,4
dinitrophenol. Sau khi nuôi cấy, nitrit giải phóng ra được chiết xuất bằng dung dịch KCl và xác định bằng máy so màu ở bước sóng 520 nm.
- 2,4 dinitrophenol 0,9 mM (166,6 mg/l) - Dung dịch chất nền: KNO3 25mM (2,53g/l) - KCl 4M (298,24g/l)
- Đệm NH4Cl 0,19M, pH=8,5 (10g/900ml, điều chỉnh pH bằng KOH 8,5%, lên thể tích đến 1000ml)
- Thuốc thử màu: Hoà 2g sunphanil amin và 0,1 g N-(1-naphthyl)-
etylendiamin hydroclorit trong 150 ml nước cất, thêm 20 ml H3PO4 đặc, làm nguội ở nhiệt độ phòng và pha loãng đến 200 ml nước cất trong bình định mức. Dung dịch không màu và chỉ dùng trong ngày.
- Dung dịch tiêu chuẩn mẹ: NO2- 1000àg/ml (4,9257g NaNO2/l), giữ ở 4oC
- Dung dịch đo chuẩn (NO2- 10àg/ml) : pha loãng dung dịch mẹ
(5ml/500ml)
- Dãy hiệu giá chuẩn: 0; 0,2; 0,4; 0,8; 1 àg NO2-/ml . Pha cho mỗi lần đo.
2. Thủ tục tiến hành
- Cân 5g đất ẩm vào 5 ống nghiệm. Dùng pipet thêm 4ml dung dịch 2-4 DNP, 1ml dịch nền, trộn nhanh rồi đậy nắp lại.
- Ủ 2 ống ở 25oC/24h và 1 ống ở -20oC/24h (ống đối chứng), sau khi ủ làm tan ở nhiệt độ phòng.
- Thêm 10ml KCl vào cả 2 mẫu và đối chứng, lắc nhẹ rồi lọc ngay.
- Để so màu cho 5ml dịch lọc, 3ml đệm NH4Cl và 2ml thuốc thử màu vào ống nghiệm, trộn đều và để đứng 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đo mẫu và đối chứng ở 520nm dựa vào phản ứng đối chứng trắng. So sánh với đường cong hiệu chỉnh chuẩn (xử lý 5ml dãy hiệu chỉnh chuẩn giống như dịch lọc).
3. Tính kết quả
Tính lượng àg N của dung dịch thử từ đường cong chuẩn
(S-C).20.100 = μg N.g-1 dm.2h-1 5.5. % dm Trong đó: S: Giá trị mẫu (μg N) C: Đối chứng (μg N)
20: Lượng chiết xuất (ml)
5: ước số dịch lọc (ml)
5: Lượng mẫu ẩm ban đầu (g)