Tầm quan trọng của photphataza đối với dinh dưỡng của cây trồng đã
được nhấn mạnh nhiều lần (Cosgrove 1967, Hayman 1975, Speir 1978, Dick và Tabatabai 1987,…). Trong hầu hết các loại đất, sự phân chia photpho hữu cơ cao hơn photpho vô cơ. Trong các este của axit photpho hữu cơ, sự phân chia lớn nhất ở trong đất là axit phytanic hoặc phytin. Photpho được hấp thụ bởi cây
trồng đòi hỏi sự khoáng hoá photpho hữu cơ bởi men photphataza thành
photphat mạch thẳng. Photphataza bao gồm các enzym được sinh ra nhiều trong điều kiện lân dễ tiêu thấp. Photphataza được bài tiết ra từ rễ cây trồng và VSV. Photphataza của VSV trội hơn ở trong đất.
Tên photphataza miêu tả một nhóm enzym thuỷ phân este cũng như andehit của axit photphoric. Có nhiều loại photphataza ở trong đất.
Để xác định hoạt tính photphataza, có thể sử dụng hoặc photphat đựơc sinh ra trong quá trình khoáng hoá các este photphat hữu cơ tự nhiên hoặc các
thành phần hữu cơ sau khi khoáng hoá các vật chất hữu cơ nhân tạo (ví dụ βnaphtylphotphat, phenylphotphat,…)
Enzym photphomonoesteraza (còn gọi là photphataza) khác nhau trong các cơ chất đặc trưng và pH tối thích của nó. Vì vậy, một trong những sự khác biệt là giữa photphataza kiềm và axit trong đất. Photphodiesteraza phân huỷ các axit nucleic và đựơc tìm thấy ở trong cây trồng, động vật và vi sinh vật. Hoạt động của Photphotriesteraza chỉ mới được phát hiện năm 1976, nhưng chưa được quan tâm nhiều. Hoạt động của polyphophataza được quan tâm đặc biệt khi được ngưng tụ, photphat vô cơ được sử dụng như phân bón cung cấp lân.
Sau khi thêm vào dung dịch phenylphotphat (muối Natri), mẫu đất được ủ ở 37oC/3h. Phenol được giải phóng chuyển màu với 2,6 dibromchinone clorit và được xác định ở bước sóng 614nm (theo phương pháp cải tiến từ phương pháp của Hoffmann, 1986).
1. Vật liệu, hoá chất
- Dung dịch nền 0,1 M: 27g Natri phenyl photphat/1000ml nước cất - Đệm axetat (pH=5):
+ Dung dịch 1: 60ml axit axetic đóng băng/1000ml nước cất + Dung dịch 2: 136g Natri axetat/1000ml nước cất
Trộn dung dịch 1 và 2 theo tỉ lệ 1:2 và điều chỉnh pH đến 5
- Đệm xitrat (pH=7): 300g trinatri xitrat/1000 ml, điều chỉnh pH bằng HCl - Đệm boric (pH=10): 12,4 g H3BO3/100ml NaOH 1M, lên thể tích 1000ml.
- Thuốc thử màu: 200mg 2,6 dibromchinone clorit/100ml etanol (60%v/v)
- Dung dịch chuẩn mẹ (1mg phenol/ml): 1g phenol/1000ml, giữ trong lọ màu. - Dung dịch chuẩn làm việc (10μg phenol/ml): pha loãng 10ml dịch mẹ/1000ml
- Dãy dung dịch chuẩn hiệu giá: Hút 0; 5;10; 15 và 20 ml dung dịch chuẩn (10μg phenol/ml) vào 5 bình nón 100ml, thêm 5ml dung dịch đệm mong muốn, 1ml thuuốc thử màu và 25ml nước cất. Sau 30 phút, lên thể tích với nước cất, trộn đều. Dãy chuẩn chứa 0,50, 100, 150 và 200 μg phenol.
2. Thủ tục tiến hành
- Cho 5g đất ẩm vào 4 bình nón 50ml, hút vào 10ml đệm axetat, citrat hoặc boric vào mỗi bình.
- Thêm 5ml dung dịch chất nền vào 3 bình (mẫu), lấy 5ml cho vào bình còn lại (đối chứng), lắc nhẹ, đậy nút và ủ ở 37oC/3h.
- Sau khi ủ, lên thể tích, lắc đều và lọc vào các ống nghiệm.
- Hút 2 ml dịch lọc (phụ thuộc vào hoạt tính của đất, lượng dịch lọc có thể
Sau đó, lên thể tích và trộn đều. Đo mật độ màu của dãy chuẩn, mẫu và đối chứng trên máy quang phổ hấp phụ ở 614nm dựa vào phản ứng đối chứng trắng trong vòng 24h.
3. Tính kết quả
Hoạt tính photphataza được biểu thị là μg phenol trên 1g chất khô và thời gian ủ. Nồng độ phenol của mẫu và đối chứng được tính từ đường cong chuẩn.
(S-C).50.100
= μg phenol.g-1 dm.3h-1 ml.5.% dm
S: Giá trị đo mẫu (μg phenol)
C: Đối chứng (μg phenol)
50: Lượng chiết xuất (ml)
ml: ước số dịch lọc (ml)
5: Lượng đất ban đầu (g)
100%-1dm: Hệ số đất khô