Để xác định chính xác DNA ngoại lai đã được chèn vào vector mong muốn, DNA plasmid mang gen tái tổ hợp đã lựa chọn được cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra. Enzyme hạn chế là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết các đoạn DNA với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn DNA đó và cắt cả hai sợi của phân tử DNA. Các enzyme hạn chế thường được sử dụng để cắt DNA: (i) Tạo đầu bằng, như Sma I, Eco RV cắt hai sợi DNA tại cùng một điểm tạo hai đầu bằng không có khả năng tự bắt cặp trở lại; (ii) Tạo đầu dính, như Hind III, Bam HI cắt theo vị trí lệch nhau trên hai sợi tạo các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại.
Sau khi đã tách dòng thành công bằng các vector tách dòng, DNA plasmid thu được từ tách chiết plasmid tái tổ hợp cần kiểm tra lại trình tự đoạn gen được nhân bằng kỹ thuật cắt enzyme giới hạn. Enzyme giới hạn được sử dụng để cắt kiểm tra bao gồm: Eco RI và Kpn I, Sma I, Hind III, Bgl II, Nco I, Not I. Các dung dịch đệm thích hợp cho từng loại enzyme như sau:
Eco RI Dung dịch đệm Eco RI
Sma I Dung dịch đệm Tango
Hind III Dung dịch đệm R
Kpn I Dung dịch đệm Kpn I
Bgl II Dung dịch đệm Tango
Not I Dung dịch đệm Tango
Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần:
H2O: 5.8 µl
Buffer: 1.0 µl
DNA plasmid: 3.0 µl
Enzyme cắt: 0.2 µl
Tổng thể tích: 10 µl
Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 37°C trong 1, 5 giờ và kiểm tra kết quả bằng điện di agarose 0,8%.