Dòng khuẩn lạc có kí hiệu pCB_xylB_hph lần lượt được cắt kiểm tra bằng một enzyme là Kpn I, Bgl II và kết hợp hai enzyme Bgl II và Nco I.
Enzyme giới hạn Kpn I để dùng để cắt vector trung gian pKS_xylB_hph với mục đích tinh chế đọan gen cần nối ghép với vector pCB1300 và vector nhận pCB1300 cũng được cắt mở vòng bằng Kpn I nên điểm cắt của Kpn I không bị mất. Vì vậy, khi xử lý DNA plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph bằng enzyme giới hạn Kpn I, kết quả thu được là hai đoạn gen có kích thước là 9 kb và 6,4 kb tương ứng với kích thước của pCB1300 và đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph. Trên hình ảnh điện di (Hình 3. 14), sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme
Kpn I gồm hai băng với kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết. Vector pCB1300
Như vậy, chúng tôi khẳng định đã chuyển được toàn bộ kết cấu gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào Ti plasmid.
Hình 3. 14: Điện di đồ sản phẩm cắt enzyme của Ti plasmid tái tổ hợp mang hai cấu trúc biểu hiện gen xylB và hph
1: Vector pCB1300 đối chứng
2: Ti plasmid pCB_xylB_hph đối chứng 3: pCB1300 cắt bằng Kpn I
4: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Kpn I 5: pCB1300 cắt bằng Bgl II
6: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Bgl II M: Marker 1 kb
7: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Bgl II và Nco I 8: pCB1300 cắt bằng Bgl II và Nco I
Tiến hành khảo sát thêm một số điểm cắt của enzyme giới hạn trên vector tái tổ hợp pCB1300_xylB_hph, enzyme Bgl II và Nco I được dùng để cắt điểm cắt nội trên đoạn gen mang hai cấu trúc (GpdA promoter + xylB gene +trypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator). Vì Bgl II có vị trí nhận biết trên gen mã hóa xylB, nên Bgl II sẽ cắt mở vòng vector tái tổ hợp pCB1300_xylB_hph. Vector pCB1300 không có vị trí cắt của Bgl II do đó, DNA plasmid của pCB1300 sẽ không bị cắt, trên điện di đồ vẫn là sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp. Tương tự, Nco I có vị trí nhận biết trên gen mã hóa hph nên khi xử lý DNA plasmid tái tổ hợp bằng Bgl II và Nco I, kết quả sẽ gồm hai băng có kích thước khoảng 10,6 kb và 4,7 kb. Đồng thời, vector pCB1300 được cắt cùng với Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph để làm đối chứng. Với cả hai phương án xứ lý bằng enzyme giới trên đều không có điểm cắt trên vector pCB1300 do đó dễ dàng nhận thấy sự khác biệt giữa sản phẩm cắt của
~15,4 ~10,7 ~ 9 ~ 6,4 ~ 4,7 1 2 3 4 5 6 M 7 8 kb
vector pCB1300 và vector lasmid tái tổ hợp pCB1300_xylB_hph trên điện di đồ. Như vậy, chúng tôi có thể khẳng định đã chuyển được đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph vào vector pCB1300. DNA plasmid tái tổ hợp được tách chiết lượng lớn và tinh sạch cho phản ứng xác định trình tự.
Đoạn gen quan tâm được xác định trình tự theo phương pháp Sanger trên máy xác định trình tự tự động ABI Avant 3100. Trình tự nucleotide của mỗi mẫu được xác định cả hai chiều xuôi và chiều ngược. Trình tự được xử lý bằng các phần mềm ABI PRIMS 3100 Avant Data Collection v1.0 và DNA Sequencing Analysis v5. 2. Trình tự gen thu được tiếp tục được so sánh với các trình tự chuẩn trong ngân hàng gen Quốc tế EMBL/ Genbank/ DDBJ hoặc các trình tự ban đầu của gen nhờ các phần mềm Seqscrape v2. 6 và Bioedit v7. 0. 9 để kiểm tra độ chính xác của trình tự gen.
10 20 30 40 50 60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
XylB ATGCTCACCAAGAACCTTCTCCTCTGCTTTGCCGCGGCTAAGGCTGCTCTGGCTGTCCCC
M L T K N L L L C F A A A K A A L A V P
70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
XylB CACGACTCTGTCGCCCAGCGTTCGGATGCCTTGCACATGCTCTCTGAGCGCTCGACCCCG
H D S V A Q R S D A L H M L S E R S T P
130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
XylB AGCTCGACCGGCGAGAACAACGGCTTCTACTACTCCTTCTGGACCGACGGCGGTGGCGAC
S S T G E N N G F Y Y S F W T D G G G D
190 200 210 220 230 240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
XylB GTGACCTACACCAACGGAGATGCTGGTGCCTACACTGTTGAGTGGCCCAACGTGGGCAAC
V T Y T N G D A G A Y T V E W P N V G N
250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
XylB TTTGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACCCCGGAAGTGCGCAGGACATCACCTACAGCGGCACC
310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
XylB TTCACCCCTAGCGGCAACGGCTATCTCTCCGTCTATGGCTGGACCACTGACCCCCTGATC
F T P S G N G Y L S V Y G W T T D P L I
370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
XylB GAGTACTACATCGTCGAGTCCTACGGCGACTACAACCCCGGCAGTGGAGGCACATACAAG
E Y Y I V E S Y G D Y N P G S G G T Y K
430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
XylB GGCACCGTCACCTCGGACGGATCCGTTTACGATATCTACACGGCTACCCGTACCAATGCT
G T V T S D G S V Y D I Y T A T R T N A
490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
XylB GCTTCCATTCAGGGAACCGCTACCTTCACTCAGTACTGGTCCGTCCGCCAGAACAAGAGA
A S I Q G T A T F T Q Y W S V R Q N K R
550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
XylB GTTGGCGGAACTGTTACCACCTCCAACCACTTCAATGCTTGGGCTAAGCTGGGAATGAAC
V G G T V T T S N H F N A W A K L G M N
610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
XylB CTGGGTACTCACAACTACCAGATCGTGGCTACCGAGGGTTACCAGAGCAGTGGATCTTCG
L G T H N Y Q I V A T E G Y Q S S G S S
670 ....|....|....|...
XylB TCCATCACTGTTCAGTAA
S I T V Q *
Hình 3. 15: Trình tự gen và trình tự amino acid của gen xylanase
Chúng tôi sử dụng phần mềm Bioedit để phân tích và so sánh trình tự giải mã được của xylB với các trình tự gen này đã công bố trên ngân hàng gen EMBL. Kết quả, đoạn gen đã được giải mã có độ dài 678 bp, mã hóa cho 205 amino acid (23 kDa). Như vậy, gen mã hóa xylanase được chuyển vào nấm sẽ là mã hóa enzyme xylanase thuộc họ 11. Đây là những enzyme rất đặc hiệu trong việc phân hủy xylan [13, 29]. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công Ti plasmid tái tổ hợp mang hai
cấu trúc biểu hiện gen xylanase và gen kháng hygromycin B. Vector này còn được gọi là vector biểu hiện gen mã hóa xylanase.