Để thiết kế vector trung gian pKS_xylB_hph, xylB và hph được lắp ghép vào vector trung gian pKS–. Tuy nhiên, cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong nấm mốc lại nằm trên vector pAN7.1 – GluA. Do vậy, hai cấu trúc trên được đưa lần lượt vào vector trung gian. Trước hết là tiến hành thiết kế vector trung gian mang cấu trúc biểu hiện xylB dựa trên vector pAN7.1 – GluA, tạo thành vector tái tổ hợp được kí hiệu là pAN_xylB.
3.1.1.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pAN_xylB mang xylB
Muốn gen hoạt động và biểu hiện ra sản phẩm protein, gen phải nằm trong một kết cấu hoàn chỉnh gồm đoạn khởi đầu ở phía trước và đoạn kết thúc ở phía sau gen, đoạn khởi đầu và kết thúc này sẽ điều khiển gen hoạt động trong tế bào chủ thích hợp [6, 22, 39]. Bởi vậy, để xylB biểu hiện được, trình tự DNA mang mã di truyền của
xylB phải được lắp ghép đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc trên
vector pAN7.1 – GluA [22].
Trước hết, trình tự của xylB được nối ghép vào vector tách dòng pJET1.2 để nhân lên lượng lớn, sau đó vector tái tổ hợp được cắt bằng enzyme Bgl II để thu lại đoạn gene mang trình tự xylB làm nguyên liệu lắp ghép vào vector pAN7.1 – GluA. Để có thể nối ghép xylB vào vector pAN7.1 – GluA, vector pAN7.1 – GluA phải được cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn. Giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc điều khiển khiển hoạt động của xylB có vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bam HI, do đó enzyme Bam HI được sử dụng để cắt vector pAN7.1 – GluA.
Hình 3. 2: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm tinh sạch của vector pAN7.1 – GluA và gen mã hóa xylanase
M: Marker 1 kb
1: Sản phẩm cắt của vector pAN7.1 – GluA bằng enzyme Bam HI 2: Sản phẩm cắt của gen mã hóa xylanase bằng enzyme Bgl II
Vector pAN7.1 – GluA được mở vòng bằng Bam HI nên sản phẩm cắt thu được trên điện di đồ (Hình 3. 2) là một băng duy nhất có kích thước khoảng 8,3 kb. Sản phẩm cắt enzyme của gen mã hóa xylanase có kích thước khoảng 0,7 kb. Hai đoạn DNA này có kích thước phù hợp với lý thuyết. Do đó, chúng sẽ được tinh sạch và nối ghép với nhau nhờ T4 DNA ligase. Do trình tự nhận biết điểm cắt của Bgl II tương đồng với trình tự cắt của Bam HI nên chúng có thể nối ghép dễ dàng. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli để thu lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp.
Trước tiên, các tế bào trong dịch nuôi cấy được thu nhận bằng cách ly tâm thu tủa. Tiếp đó chúng được xử lý bằng dung dịch I (có tác dụng rửa sạch tế bào), sau đó phá màng tế bào bằng dung dịch II. Các cấu trúc của tế bào cũng như các liên kết hydro trong phân tử bị phá vỡ. SDS cùng với EDTA trong dung dịch II còn có vai trò ức chế các nuclease do EDTA liên kết các ion Mg2+ (yếu tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease), vì vậy ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết. Tế bào vi khuẩn E. coli có chứa hai dạng DNA: DNA nhiễm sắc thể của
E. coli và DNA plasmid nên việc tách riêng, làm sạch DNA plasmid là rất quan trọng.
Kb M 1 2 ~ 8,3 kb ~ 0,7 kb 8 0, 75 0,5
DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dung dịch I, II, III. DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn lại liên kết chặt chẽ với protein trong phức chất nucleoprotein nên khoảng thời gian ngắn không kịp thoát ra ngoài. Trong khi đó, các phân tử DNA plasmid mạch vòng đã được giải phóng ra môi trường. Khi môi trường được xử lý tiếp với dung dịch III thì pH môi trường trở về khoảng acid yếu gắn với điểm đẳng điện của DNA. Vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và được kiểm tra kích thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3. 3: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang xylB
1 – 15: Plasmid tái tổ hợp của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pAN_xylB từ (1 – 15)) 16: Đối chứng – vector pAN7.1 – GluA
Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai sẽ có kích thước lớn hơn plasmid không được chèn thêm đoạn gen ngoại lai (hay được gọi là plasmid gốc). Do vậy, độ cao thấp của các băng trên hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid so với băng đối chứng là cơ sở ban đầu để dự đoán dòng nào đã được chèn thêm đoạn DNA ngoại lai. Trên điện di đồ (Hình 3.3), hầu hết DNA plasmid tái tổ hợp đều cao hơn so với DNA plasmid đối chứng. 4 plasmid có thứ tự từ giếng 1 – 4 tương ứng với các dòng khuẩn lạc có kí hiệu pAN_xylB1; pAN_xylB2, pAN_xylB3 và pAN_xylB4 được tinh sạch và dùng làm khuôn cho PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho xylB: XylB – F và XylB – R kiểm tra sự có mặt của xylB trong vector pAN – GluA.
Hình 3. 4: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB trong vector tái tổ hợp pAN_xyB bằng PCR
M:Marker 1 kb
1 – 5: Sản phẩm PCR của dòng khuẩn lạc pAN_xylB6– 10
Trên điện di đồ (Hình 3. 4), các băng ở giếng 1 – 5 tương ứng với dòng khuẩn lạc pAN_xylB(6 – 10), đều có kích thước khoảng 0,7 kb, bằng với kích thước lý thuyết của gen xylB. Do đó, chúng tôi khẳng định đã nối ghép thành công xylB vào vector pAN7.1 – GluA.
PCR được sử dụng để kiểm tra chiều gắn của đoạn xylB trên vector pAN - GluA. Tuy nhiên, PCR bằng cặp mồi đặc hiệu của xylB không thể phân biệt được chiều gắn của xylB vì chúng chỉ nhân lên đúng trình tự của xylB. Kỹ thuật cắt enzyme giới hạn cũng không thể áp dụng được bởi không lựa chọn được enzyme phù hợp. Chính vì thế chúng tôi đã thiết kế mồi SeqXylB – F kết hợp với mồi XylB – R để kiểm tra chiều gắn của xylB bằng kỹ thuật PCR. Mồi SeqXylB – F sẽ bắt cặp với trình tự trên đoạn khởi đầu GpdA của xylB, mồi XylB – R sẽ bắt cặp trên trình tự
xylB. Nếu xylB lắp ghép đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc thì kích
thước sản phẩm PCR sẽ khoảng 1,2 kb; ngược lại nếu lắp không đúng chiều PCR sẽ không có sản phẩm.
Kb M 1 2 3 4 5
~ 0,7 kb 0,7
Hình 3. 5: Điện di đồ kiểm tra chiều gắn của
xylB trong vector
tái tổ hợp pAN_xylB bằng PCR sử dụng cặp mồi Seq – F và XylB – R
M: Marker 1 kb
1 – 5: Sản phẩm PCR của các dòng pAN_xylB (6 – 10)
Sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp ở giếng số 1 và giếng số 3 (Hình 3. 5) tương ứng với dòng khuẩn lạc có kí hiệu pAN_xylB1 và pAN_xylB3 xuất hiện băng đặc hiệu với kích thước khoảng 1,2 kb. Kích thước này đúng bằng kích thước lý thuyết. Như vậy, chúng tôi đã chọn được dòng plasmid tái tổ hợp mang xylB lắp đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc trên vector pAN7.1 – GluA. Dòng plasmid pAN_xylB6 và pAN_xylB8 được nuôi lượng lớn và giữ chủng nhằm phục vụ cho các nghiên cứu sau.
3.1.1.2. Lắp ghép xylB trong vector pAN_xylB vào vào vector trung gian
Sản phẩm để nối ghép vào vector trung gian pKS– là cấu trúc gồm: đoạn khởi đầu + xylB + đoạn kết thúc (GpdA + xylB + TrypC) hay còn gọi là cấu trúc biểu hiện
xylB, cấu trúc này có kích thước khoảng 4,2 kb. Enzyme Eco RI và Sma I được dùng
để cắt hoàn toàn cấu trúc (GpdA + xylB + TrypC) trên vector tái tổ hợp pAN_xylB. Theo lý thuyết, sản phẩm cắt enzyme thu được 4 băng, trong đó có hai băng có kích thước tương đương nhau, khoảng 4, 2 kb nên rất khó phân tách. Đó là hai đoạn tương ứng với đoạn gen có cấu trúc biểu hiện xylB và một đoạn khác cũng cắt từ vector Kb M 1 2 3 4 5
~ 1,2 kb 1.5
pAN_xylB. Vì vậy, plasmid tái tổ hợp cần tiếp tục được kiểm tra lại bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt enzyme giới hạn.
Sau khi lựa chọn một số dòng cao hơn đối chứng âm (vector pAN7.1 – GluA). DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc này được tinh sạch và kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB trong vector tái tổ hợp pKS_xylB bằng PCR sử dụng cặp mồi SeqXylB – F và XylB – R.
Hình 3. 6: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB trên vector trung gian bằng PCR
M: Marker 1 kb
1 – 4: Sản phẩm PCR của các dòng khuẩn lạc pKS_xylB(1, 3, 8, 9)) Trên điện đồ (Hình 3. 6), sản phẩm PCR rất đặc hiệu với kích thước khoảng 1,2 kb, sáng và rất đặc hiệu phù hợp với tính toán lý thuyết. Như vật, chúng đã chuyển thành công gen mã hóa xylanase vào vector trung gian pKS-. Như vậy, chúng đã chuyển thành công gen mã hóa xylanase vào vector trung gian và vector này bước đầu được kí hiệu là pKS_xylB. Các plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng cắt enzyme
Sma I và Eco RI. Hai enzyme có điểm cắt ngoại, tức là điểm cắt ở hai đầu đoạn gen
ngoại lai trên vector tái tổ hợp pKS_xylB. Theo lý thuyết, sản phẩm cắt enzyme của plasmid tái tổ hợp pKS_xylB sẽ có kích thước khoảng 3 kb và 4,2 kb.
Kb M 1 2 3 4
~ 1,2 kb 1,5
1
Hình 3. 7: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp pKS_xylB bằng enzyme Sma I và Eco RI
M: Marker 1 kb
P: plasmid tái tổ hợp pKS_xylB9
pKS: Sản phẩm cắt của khuẩn lạc pKS_xylB bằng enzyme Sma I và Eco RI Vì cấu trúc GpdA promoter + xylB gene + TrypC terminator được cắt bằng
Sma I và Eco RI để nối ghép vào vector KS- cũng đã được cắt bằng hai enzyme
tương tự nên điểm cắt của hai enzyme này không bị mất đi. Do đó vector tái tổ hợp KS_xylB có thể dễ dàng được kiểm tra sự có mặt của xylB bằng cách cắt kiểm tra bằng Sma I và Eco RI. Sản phẩm cắt enzyme của tất cả các mẫu được kiểm tra trên hình ảnh điện di (Hình 3. 7) đều gồm 2 băng có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyế: 4,2 kb (kích thước của đoạn gen ngoại lai (GpdA promoter + xylB gene + TrypC terminator) và khoảng 3 kb (kích thước của vector KS-)). Như vậy, chúng tôi khẳng định đã chuyển thành công cấu trúc (GpdA promoter + xylB gene + TrypC