gian (pKS_xylB_hph)
Theo lý thuyết, khi xử lý vector trung gian đã mang cả hai xylB và hph bằng
Kpn I, sản phẩm cắt thu được là hai đoạn có kích thước 6,4 kb và 3 kb, trong đó 6,4
kb là kích thước tương ứng với hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph và 3 kb là kích thước của vector pKS-. Phản ứng cắt enzyme được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ 37°C trong 1,5 giờ.
Hình 3. 12: Điện di sản đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pKS_xylB_hph bằng enzyme Kpn I
1. DNA plasmid pKS_xylB_hph M: Marker 1 kb
2 – 3: Sản phẩm cắt của plasmid tái tổ hợp có kí hiệu pKS_xylB_hph(9, 18) bằng enzyme Kpn I
Vì kích thước của sản phẩm cắt enzyme lớn, DNA plasmid được điện di cùng để làm đối chứng. Nhờ vậy dễ dàng phân biệt được sản phẩm cắt enzyme trong những trường hợp xử lý enzyme không hoàn toàn hoặc enzyme không hoạt động. Trên điện di đồ (Hình 3. 12), sản phẩm cắt enzyme của 2 dòng plasmid trên giếng số 2 và giếng số 3 gồm hai băng rất rõ nét. Một băng có kích thước khoảng 3 kb (kích thước của vector pKS–); một băng có kích thước 6,4 kb (kích thước của cả cấu trúc biểu hiện xylB và hph có trong vector trung gian). Kích thước này hoàn toàn phù hợp
~ 6,4 ~ 3 kb 1 M 2 3 kb
6 3
với kích thước lý thuyết. Để khẳng định chính xác trình tự được chuyển vào là trình tự xylB và trình tự hph, dòng plasmid tái tổ hợp có kí hiệu pKS_xylB_hph9 được tiếp tực kiểm tra bằng kỹ thuật PCR.
Hình 3. 13: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector trung gian pKS_xylB_hph9
M: Marker 100 bp
1: Sản phẩm PCR của hph 2: Sản phẩm PCR của gen xylB
Sản phẩm PCR của xylB và hph rất đặc hiệu (Hình 3. 13) và có kích thước đúng bằng kích thước lý thuyết: xylB có kích thước khoảng 0,7 kb và hph có kích thước khoảng 0,6 kb. Do vậy, chúng tôi khẳng định đã thiết kế thành công vector trung gian pKS_xylB_hph mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph. Dòng plasmid tái tổ hợp có kí hiệu pKS_xylB_hph được nuôi lượng lớn để dùng cho các nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase.