* Chuẩn bị nấm sợi A. niger để thu bào tử
Cấy ria từ ống giữ chủng A. niger trong glycerol ở – 80°C lên đĩa nuôi cấy có chứa môi trường PDA. Dịch còn lại giữ ở – 20°C.
Ủ đĩa nuôi cấy ở 30°C trong 3 ngày, trong tối.
Thu hoạch bào tử nấm: bổ sung 5 ml nước muối sinh lý vô trùng và dùng que trải gạt nhẹ nhàng lên bề mặt thạch để thu bào tử.
Chuyển bào tử qua màng lọc vào ống falcon 15 ml và tiếp tục bổ sung thêm 5ml nước muối sinh lý.
Ly tâm 10 phút, 8000 v/p, ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi và hòa tan cặn trong 1ml nước muối sinh lý.
Xác định nồng độ bào tử và pha loãng đến nồng độ cuối cùng là 107 bào tử/ml bằng môi trường IM.
* Chuẩn bị chủng A. tumefaciens
A. tumefaciens mang Ti plasmid tái tổ hợp được cấy ria lên môi trường LC có bổ sung kháng sinh rifampicin 50 mg/ml để ngăn ngừa sự lây nhiễm các vi khuẩn khác và bổ sung đồng thời cả kanamycin 50 mg/ml để chọn lọc A. tumefaciens có mang Ti plasmid tái tổ hợp. Ủ đĩa ở 28°C trong 2 ngày
Nhặt 2 khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy cho vào 20 ml môi trường LC đã bổ sung 50 mg/ml rifampicin và 50 mg/ml kanamycin, nuôi lắc ở 28°C, 250 v/p trong 24 giờ.
Ly tâm dich nuôi cấy trong Eppendorf 1.5 ml trong 10 phút, 6000 v/p ở nhiệt độ phòng. Bỏ dịch nổi, thu cặn và tiếp tục rửa cặn bằng cách hòa tan cặn trong 250 µl dung dịch IM. Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi.
Hòa tan cặn trong 5 ml dung dịch IM có chứa 5µl AS nồng độ 0.2M
Ủ dịch nuôi cấy ở 28°C từ 4 giờ – 5 giờ, lắc 100 v/p.
Đo OD600nm và pha loãng ra nồng độ cuối cùng là 0.8 (4.108 – 5.108 vi khuẩn/ml).
* Nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger:
Trộn 100 µl tế bào A. tumefaciens (OD600nm = 0.8) và 100 µl bào tử nấm (nồng độ = 107 bào tử/ml).
Sử dụng kẹp vô trùng đặt màng lọc lên đĩa petri có chứa môi trường thạch IM đã bổ sung AS 0.2M.
Dùng pipet hút 200 µl hỗn hợp bào tử nấm và vi khuẩn lên trên màng lọc và trải đều bằng que trải.
Ủ đĩa ở 24°C trong 3 ngày.
* Chọn lọc nấm chuyển gen:
Dùng kẹp vô trùng chuyển màng lọc có hỗn hợp dịch nuôi cấy lên đĩa môi trường PDA đã bổ sung cefotaxim (50 mg/ml) và hygromycin (50 mg/ml)
Ủ đĩa ở 30°C trong 3 ngày, trong tối cho đến khi xuất hiện bào tử.
Nhặt khuẩn lạc sang môi trường chọn lọc để làm sạch và phân lập riêng rẽ từng bào tử.
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Gen mã hóa xylanase muốn được chuyển vào nấm mốc A. niger thông qua A.
tumefaciens thì phải được gắn vào giữa hai vùng biên phải và trái (LB và RB) của T –
DNA trên Ti plasmid. Để giải phóng T – DNA có đoạn DNA ngoại lai, A.
tumefaciens được nuôi chung với bào tử nấm trong môi trường có bổ sung chất cảm
ứng AS, cảm ứng gen vir để chuyển gen mong muốn sang tế bào chủ. Nấm mốc chuyển gen được chọn lọc dựa trên đặc tính của đoạn DNA ngoại lai hoặc biểu hiện ra sản phẩm protein. Thông thường, cơ thể chuyển gen được chọn lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh thích hợp [8].
Tiến hành khảo sát một số vector pCAMBIA1300, chúng tôi lựa chọn Ti plasmid vector pCB1300 vì vùng T – DNA của vector này có vị trí nhận biết của nhiều enzyme giới hạn phù hợp với chiến lược thiết kế vector đã đặt ra. Để tạo chủng
Agrobacterium làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm, việc đầu tiên là thiết kế Ti
plasmid vector biểu hiện, vector này được kí hiệu pCB_xylB_hph gen mã hóa xylanase (xylB) và gen kháng hygromycin B (hph).
Vector tái tổ hợp Ti plasmid được kiểm tra bằng cắt enzyme giới hạn hoặc PCR hoặc giải trình tự gen trước khi chuyển vào Agrobacterium. Chủng vi khuẩn A.
tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph được nuôi nhiễm với bào tử nấm A. niger. Nấm chuyển gen sẽ được tiếp tục chọn lọc trên môi trường có bổ sung chất
kháng sinh thích hợp. Toàn bộ quy trình thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc được thể hiện chi tiết qua sơ đồ sau:
3.1. Thiết kế vector trung gian (pKS_xylB_hph) mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph