3.1.2. Lắp ghép cấu trúc GluA promoter + hph gene + TrypC terminator vào vector trung gian trung gian
Cấu trúc (GluA promoter + xylB gene + TrypC terminator) đã được lắp ghép thành công vào vector trung gian, tạo thành vector tái tổ hợp pKS_xylB. Tuy nhiên, việc chọn lọc/ sàng lọc các thể tái tổ hợp thông thường cần sự có mặt của các gen chỉ thị như các gen kháng kháng sinh [20]. Trên cơ sở vector pAN7.1 – GluA nhận được từ Phòng Công nghệ sinh học enzyme, chúng tôi tiến hành thiết kế vector tái tổ hợp
6 2,5 ~ 4,2 kb
mang gen kháng kháng sinh (hph) để làm nguyên liệu lắp ghép tiếp vào vector trung gian.
3.1.2.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pJET_hph
Hph không thể lắp ghép trực tiếp vào vector trung gian vì theo chiến lược thiết
kế vector đã đề ra, cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B nằm trên vector trung gian sẽ được chuyển vào Ti plasmid bằng cách cắt mở vòng Ti plasmid và vector trung gian bằng enzyme Kpn I do không chọn được enzyme khác thích hợp. Do đó, hai đầu của đoạn gen có cấu trúc biểu hiện xylB và hph trên vector trung gian phải là vị trí nhận biết của Kpn I. Trên vector trung gian đã được ghép nối với xylB chỉ có một điểm cắt của Kpn I. Muốn xuất hiện điểm cắt thứ hai của Kpn I, chúng tôi phải chuyển qua một vector pKS– khác và tạo thành vector tái tổ hợp có kí hiệu pKS_hph. Trên vector pKS– cũng có điểm cắt của Kpn I, tuy nhiên nếu chuyển trực tiếp cấu trúc biểu hiện hph từ vector tái tổ hợp pKS_hph sang vector trung gian sẽ làm mất điểm cắt của Kpn I, hoặc vẫn chỉ có một điểm cắt của Kpn I và vector trung gian được tạo thành sẽ rất khó để tinh chế và nối ghép với Ti plasmid vector vì không có enzyme nào thích hợp cho cả hai vector trên. Do vậy, cấu trúc biểu hiện hph nằm trên vector tái tổ hợp pKS_hph được tách dòng bằng vector pJET1.2.
* Lắp ghép hph vào vector pKS–
Vector pAN – GluA được cắt bằng enzyme Sma I và Hind III để thu đoạn gen gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) và nối ghép với vector nhận pKS– cũng được cắt bằng hai enzyme tương tự. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli. Các DNA plasmid sẽ được điện di trên gel agarose 0,8 % cùng với đối chứng âm (vector pKS– không có đoạn chèn), một số plasmid đại diện ở các mẫu cao hơn đối chứng âm được dùng để kiểm tra sự có mặt của hph bằng kỹ thuật PCR bằng cặp mồi đặc hiệu của hph: hph1 và hph2.
Hình 3. 8: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của hph trong vector tái tổ hợp pKS_hph bằng kỹ thuật PCR
M: Marker 100bp
1 – 9: sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp pKS_hph (kí hiệu pKS_hph (1 – 9) Sản phẩm PCR của tất cả các dòng khuẩn lạc đều xuất hiện một băng duy nhất có kích thước khoảng 0,6 kb (Hình 3. 8). Kích thước này phù hợp với kích thước lý thuyết. Do đó, chúng tôi khẳng định đã chuyển được hph vào vector pKS–. DNA của các dòng plasmid tái tổ hợp pKS_hph (1 – 3) được dùng làm khuôn để tổng hợp cấu trúc gen bao gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi M13. Sản phẩm PCR nhận được là cấu trúc gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) và sản phẩm PCR được dùng làm đoạn chèn vào vector pJET1.2.
* Lắp ghép hph trong vector tái tổ hợp pKS_hph vào vector pJET1.2
Theo lý thuyết, sản phẩm PCR khi sử dụng cặp mồi M13 với khuôn là DNA plasmid pKS_hph có kích thước khoảng 2,5 kb.
Hình 3. 9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR bằng mồi M13 của các plasmid tái tổ hợp pKS_hph
1 – 3: Sản phẩm PCR của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pKS_hph (1–3)) M: Marker 1 kb
Kết quả PCR bằng cặp mồi M13 (Hình 3. 9) thu được một băng đặc hiệu có kích thước khoảng 0,6 kb. Sản phẩm PCR được nhân lên bằng enzyme đầu bằng, do đó chúng tôi đã gắn vào vector tách dòng đầu bằng pJET1.2 của hãng Fermentas được sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm trên thế giới. Vector này chứa điểm khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E.coli. Trên vector có gen kháng chất kháng sinh (bla), nên chỉ có những tế bào nào có mang vector này mới có thể sống được trong môi trường có ampicillin. Đồng thời trên vector pJET1.2 còn chứa gen gây chết eco47IR mã hoá cho enzyme phân huỷ DNA nhân khi tồn tại trong tế bào vật chủ. Vì vậy vector gắn thêm đoạn ngoại lai sẽ làm lệch khung đọc của gen khiến enzyme được tổng hợp không còn hoạt tính như trước nữa. Thêm vào đó, vùng MCS (Multiple Cloning Site) của vector có chứa điểm nhận biết của nhiều enzyme hạn chế như Kpn I, Xho I, Xba I…nhằm phục vụ cho việc cắt kiểm tra sau khi đã tách dòng. Ngoài ra, trên vector mang trình tự hai mồi pJET1.2 xuôi và ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR cho phép nhân đoạn PCR được gắn vào sau tách dòng với số lượng lớn, phục vụ cho việc xác định trình tự gen.
~2,5kb kb 3
2,5
Sản phẩm PCR của cấu trúc biểu hiện gen hph được tiến hành gắn với vector pJET1.2, sau đó biến nạp các sản phẩm nối ghép vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α (là loại vi khuẩn được dùng khá phổ biến tại các phòng thí nghiệm vì chúng có khả năng tái bản cao). Các tế bào khả biến sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung amp (50 µg/ml) ở 37˚C qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc và đã tiến hành tách chiết DNA plasmid của các khuẩn lạc này. Sau khi sơ bộ sàng lọc các dòng mang plasmid kích thước lớn hơn vector pJET1.2 (Hình 3. 10), chúng tôi đã xử lý enzyme giới hạn Sma I và Not I với 3 dòng khuẩn lạc pJET_hph (1 – 3).
Hình 3. 10: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET_hph mang cấu trúc (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC)
1 – 23: DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu là pJET_hph (1 – 23) 24: Đối chứng – vector pJET1.2
Vì ghép nối GluA promoter + hph + TrypC ter vào vector pJET1.2, chúng đã được xử lý với enzyme Sma I và Not I nên điểm cắt của hai enzyme không bị mất đi, chúng trở thành điểm cắt ở hai đầu của đoạn gen ngoại lai chèn vào vector pJET1.2. Trên điện di đồ (Hình 3. 11), sản phẩm cắt của các dòng tái tổ hợp pJET_hph (1 – 3) bằng enzyme Sma I và Not I đều gồm 2 đoạn tương ứng với hai băng có kích thước là 2,5 kb (kích thước của cấu trúc (đoạn khởi đầu GluA + gen hph + đoạn kết thúc TrypC) và 3 kb (kích thước của vecotr pJET1.2). Do đó, chúng tôi khẳng đã lắp ghép
thành công cấu trúc biểu hiện gen kháng hygromycin B (GluA promoter + gen hph + TrypC ter) trong vector tái tổ hợp pKS_hph vào vector pJET1.2. Plasmid tái tổ hợp pJET_hph được nuôi lượng lớn để dùng làm nguyên liệu cho thiết kế vector trung gian mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B pKS_xylB_hph.
Hình 3. 11: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET1_hph bằng cắt enzyme Sma I và Not I
M: Marker 1 kb
1 – 3: Sản phẩm cắt của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pJET_hph (1 – 3) bằng
Sma I và Not I
3.1.2.2. Lắp ghép cấu trúc biểu hiện hph trong vector tái tổ hợp pJET_hph vào vector trung gian
Cấu trúc biểu hiện xylB đã được nối ghép vào vector trung gian mà không làm mất điểm cắt của Sma I và Not I. Hơn nữa, điểm cắt của Kpn I trên vector tái tổ hợp pJET_hph cũng sẽ không bị mất nếu cắt vector tái tổ hợp pJET_hph bằng enzyme
Not I vì Not I nằm phía sau Kpn I. Do đó, vector tái tổ hợp pJET1.2 và vector trung
gian được cắt bằng enzyme Sma I và Not I, sau đó nối ghép lại với nhau bằng T4 DNA ligase. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào tế bào E. coli. DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc đã được tách chiết và kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt enzyme.
Kb M 1 2 3
3 2,5
~ 3 kb ~ 2,5 kb