L ỜI CẢM ƠN
4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.2. Khảo sát các điều kiện MT ảnh hưởng đến hoạt tính kháng sinh của các chủng
(A: khuẩn ty, B: bào tử)
So với chủng T. cf.aureoviride ban đầu, chủng ĐB283 là chủng có nhiều sự sai khác về hình thái KL, hình dạng bào tử. Tuy nhiên, năng suất sinh tổng hợp CKS của chủng này giảm rất nhiều so với chủng ban đầu (7,0mm so với 25,0mm).
Sau khi khảo sát đặc điểm hình thái và hoạt tính ĐK của các chủng. Chủng ĐB108 có sự thay đổi khả năng sinh CKS theo chiều dương, chủng này được chọn trong các chủng đột biến để khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh CKS cùng với chủng gốc T. cf.aureoviride.
3.2. Khảo sát các điều kiện MT ảnh hưởng đến hoạt tính kháng sinh của các chủng chủng
a/ Ảnh hưởng của MT đến khả năng sinh tổng hợp CKS
Các loại môi trường khác nhau có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của các chủng NS.
Để xác định môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng cũng như hoạt tính đối kháng của các chủng NS nghiên cứu, chúng tôi tiến hành nuôi cấy hai chủng này trên các loại môi trường khác nhau trong thời gian là 5 ngày.
Sau đó, thu sinh khối và dịch KS thô. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính kháng sinh của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108
Môi trường
Sinh khối (g) Hoạt tính KS (D-d,mm)
T. cf.aureoviride ĐB108 cf.aureoviride T. ĐB108 MT 1 0,45 0,47 19,00 23,00 MT 2 0,43 0,53 26,00 26,40 MT 3 0,51 0,38 10,30 22,80 YEA 0,67 0,51 22,00 25,00 MEA 0,73 0,70 30.50 30,00 PGA 0,83 0,85 29,00 35,00 D 0,58 0,43 19,00 21,00 Czapek 0,27 0,50 10,00 13,00 Czapek- Dox 0,32 0,30 20,00 13,00
Hình 3.10. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính KS của chủng
T. cf.aureoviride
Hình 3.11. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính KS của chủng ĐB108
Hình 3.12. Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng của chủng
T. cf.aureoviride và chủng ĐB108
Qua kết quả trên cho ta thấy chủng T. cf.aureoviride sinh trưởng tốt nhất trong môi trường PGA và có hoạt tính đối kháng cao nhất trong môi trường MEA, đối với chủng ĐB108, trong môi trường PGA thì quá trình sinh trường và hoạt tính KS cao nhất. Môi trường PGA chứa nguồn cacbon là tinh bột phù hợp cho sinh trưởng của cả hai chủng nên trong MT này chúng đều có khả năng sinh trưởng cao nhất. Ngoài ra, trong MT này còn chứa nhiều hợp chất phù hợp cho sinh trưởng của hai chủng như các vitamin trong khoai tây. Tuy nhiên, khả năng hình thành CKS của mỗi chủng khác nhau, có thể các chất trong
cao malt và pepton phù hợp cho chủng gốc T. cf.aureoviride tạo CKS và chủng ĐB108 thích hợp với chất có nguồn gốc từ khoai tây.
Hình 3.13. Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính ĐK của chủng
T. cf.aureoviride và chủng ĐB108
b/ Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của 2 chủng NS
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như NS, cacbon tham gia trong hầu hết các cấu trúc của tế bào. Các hợp chất cung cấp cacbon có ý nghĩa quan trọng hàng đầu đối với sự sống của tế bào VSV.
Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của các chủng nghiên cứu, tiến hành nuôi cấy chủng T. cf.aureoviride trên môi trường MEA, chủng ĐB108 được nuôi cấy trên môi trường PGA nhưng nguồn cacbon được thay thế lần lượt là CMC, succrose, fructose, glucose, rỉ đường, maltose, galactose, lactose, tinh bột.
Sau thời gian nuôi cấy 5 ngày, lọc dịch nuôi cấy. Thu sinh khối, cân để xác định khả năng sinh trưởng và thử hoạt tính ĐK bằng phương pháp đục lổ.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau đến sinh trưởng và sinh CKS của
T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Nguồn
cacbon
Sinh khối (g) Hoạt tính KS (D-d,mm)
T. cf.aureoviride ĐB108 cf.aureoviride T. ĐB108 CMC 0,52 0,35 30,00 26,00 Succrose 0,41 0,46 27,00 32,00 Fructose 0,50 0,50 31,00 31,00 Glucose 0,37 0,51 30,50 31,30 Rỉ đường 0,44 0,45 33,00 37,00 Maltose 0,34 0,43 28,80 32,00 Galactose 0,42 0,45 34,00 32,70 Lactose 0,39 0,45 31,50 33,00 Tinh bột 0,42 0,49 30,00 30,30
Hình 3.14. Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng của chủng
T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Biểu đồ trên chỉ ra rằng các nguồn cacbon khác nhau đều thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108. Tuy nhiên, ở chủng ban đầu nguồn CMC cho sinh khối cao hơn so với các nguồn cacbon khác, ở chủng ĐB108 thì nguồn cacbon glucose cho sinh khối cao hơn các loại cacbon còn lại. Do chủng ban đầu sống trong môi trường rừng ngập mặn nên nguồn cacbon là CMC (celullose) phù hợp hơn các nguồn cacbon là đường chuẩn khác. Ở chủng đột biến, có sự thay đổi về đặc điểm sinh hóa nên glucose trở nên thích hợp cho sinh trưởng của chủng này.
Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Hoạt tính kháng sinh của chủng đột biến ĐB108 và chủng ban đầu T. cf.aureoviride
thay đổi ít theo nguồn cacbon. Điều này phù hợp với kết quả sinh trưởng của hai chủng, cũng như nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp (2010) về sự phát triển và hình thành sản phẩm trao đổi chất bậc hai của Trichoderma trên các nguồn cacbon khác nhau.
Theo kết quả trên đồ thị, chủng T. cf.aureoviride có hoạt tính KS mạnh nhất khi phát triển trong MT có nguồn cacbon là galactose, chủng ĐB108 có hoạt tính KS mạnh nhất đối với nguồn cacbon là rỉ đường, điều này được giải thích là do rỉ đường có nhiều thành phần khác như các vitamine, khoáng chất cần thiết cho việc trao đổi chất, hình thành chất KS của chủng này.
Do đó, trong các thí nghiệm khảo sát hoạt tính ĐK của các chủng NS tiếp theo, chúng tôi sử dụng galactose là nguồn cacbon cho chủng ban đầu T. cf.aureoviride và sử dụng rỉ đường cho chủng đột biến ĐB108.
c/ Ảnh hưởng của độ mặn môi trường đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của 2 chủng NS
Khả năng chịu mặn là đặc điểm quan trọng của các chủng NS rừng ngập mặn. Để khảo sát ảnh hưởng của yếu tố này đến sự sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của 2 chủng NS nghiên cứu, chúng tôi nuôi cấy chủng T. cf.aureoviride trong môi trường MEA và chủng
ĐB108 trong môi trường PGA có độ mặn thay đổi từ 0,0%; 2,0%; 2,5%; 3,0%; 3,5%; 4,0%; 4,5%; 5,0%; 5,5%.
Sau thời gian nuôi cấy 5 ngày, lọc thu dịch lên men, cân sinh khối và thử hoạt tính KS bằng phương pháp đục lỗ.
Kết quả sinh trưởng và hoạt tính ĐK được trình bày trong bảng 3.5
Bảng 3.5. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS ở các độ mặn khác nhau
Độ mặn (NaCl,%)
Sinh khối (g) Hoạt tính ĐK (D-d,mm)
T. cf.aureoviride ĐB108 cf.aureoviride T. ĐB108 0,0 0,40 0,83 18,00 21,0 2,0 0,42 0,92 19,00 15,00 2,5 0,58 0,93 21,00 9,00 3,0 0,60 0,74 22,00 5,00 3,5 0,80 0,72 11,00 7,00 4,0 0,65 0,41 0,00 2,00 4,5 0,66 0,50 0,00 0,00 5,0 0,58 0,58 0,00 0,00 5,5 0,42 0,55 0,00 0,00
Hình 3.16. Biểu đồ ảnh hưởng của độ mặn môi trường đến khả năng
sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Hình 3.17. Ảnh hưởng của độ mặn môi trường đến khả năng hình thành CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Qua đồ thị chúng ta nhận thấy, ở chủng ban đầu, hoạt tính tăng khi nồng độ muối tăng từ 0,0% đến 3,0%. Từ nồng độ NaCl 3,5% trở đi, hoạt tính KS của chủng giảm mạnh, ở 4,0% hoạt tính KS của chủng mất hoàn toàn. Điều này phù hợp vì chủng này được phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ nơi đây thường xuyên có nước biển lên xuống theo thủy triều, nồng độ muối môi trường cũng thường dao động quanh giá trị 3,0-4,0%. Khả năng sinh trưởng của chủng gốc kém khi nồng độ NaCl thấp, khi độ mặn tăng dần thì quá trình sinh trưởng của chủng này tăng, sinh khối của chủng đạt cao nhất khi nồng độ muối là 3,5%.
Đối với chủng đột biến, hoạt tính kháng sinh thể hiện cao nhất ở nồng độ 0,0% do đột biến làm mất đi khả năng chịu mặn của chủng ĐB108 so với chủng gốc. Hoạt tính của chủng ĐB108 giảm dần khi nồng độ muối tăng, từ nồng độ 4,5% chủng mất hoạt tính KS, giá trị này cao hơn so với chủng ban đầu.
Độ mặn của môi trường nuôi cấy nấm sợi có ảnh hưởng khác nhau đến sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp CKS của cả hai chủng NS nghiên cứu. Đối với chủng T.
cf.aureoviride, giá trị nồng độ NaCl trong môi trường thích hợp cho sinh trưởng và sinh
đổi rất lớn. Điều này có thể giải thích do tác động của tia UV làm thay đổi đặc tính của chủng đột biến so với chủng gốc ban đầu.
d/ Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của 2 chủng NS
Nitơ cùng với cacbon tham gia trong các thành phần cấu trúc nên tế bào VSV, giúp tế bào hoàn thiện mọi chức năng của hoạt động sống.
Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau đến khả năng sinh trưởng của các chủng nghiên cứu sử dụng môi trường dịch thể MT 1 nhưng nguồn NaNO3 được thay lần lượt bằng cao thịt, cazein, bột đậu, NH4Cl, NH4NO3, NaNO2, NH4H2PO4 với hàm lượng tương đượng. Sau thời gian nuôi cấy, lọc dịch nuôi cấy thu sinh khối và dịch lên men để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và khả năng sinh CKS của 2 chủng nghiên cứu.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Nguồn nitơ Sinh khối (g)
Hoạt tính KS (D-d,mm) T. cf.aureoviride ĐB108 T. cf.aureoviride ĐB108 Bột đậu 0,90 0,83 29,00 29,00 Pepton 0,76 0,67 31,20 34,00 Casein 0,64 0,57 28,30 31,80 Cao thịt 0,82 0,86 31,00 31,00 (NH4)2HPO4 0,45 0,56 30,00 30,00 NH4NO3 0,47 0,50 31,00 33,00 NH4Cl 0,53 0,41 29,00 29,30 NaNO3 0,39 0,48 23,00 31,00 NaNO2 0,34 0,40 28,00 26,50
Hình 3.18. Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Hình 3.19. Đồ thị ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng hình thành CKS của chủng
T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Từ biểu đồ cho thấy nguồn nitơ hữu cơ có tác dụng tốt đối với sinh trưởng của cả hai chủng nấm nghiên cứu, nguồn nitơ vô cơ cũng được sử dụng nhưng sự sinh trưởng kém hơn so với nguồn nitơ hữu cơ. Nguồn nitơ hữu cơ như bột đậu nành, casein do ngoài việc cung
cấp nitơ cho sự phát triển của nấm còn bổ sung thêm một lượng các vitamine và khoáng nên có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của các chủng nấm tốt hơn.
Đối với khả năng sinh tổng hợp CKS, nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ có tác động gần giống nhau, mức chênh lệch giữa các nguồn nitơ khác nhau là không lớn lắm. Như vậy, nitơ có ảnh hưởng khác nhau đối với quá trình sinh trưởng và tổng hợp CKS của chủng chủng T.
cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108. Dựa vào kết quả trên, trong các thí nghiệm tiếp
theo, chúng tôi sử dụng pepton trong MT nuôi cấy các chủng NS nghiên cứu.
e/ Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của chủng T.
cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
pH môi trường nuôi cấy VSV nói chung, nuôi cấy NS nói riêng rất quan trọng, mỗi loại NS có khả năng sinh trưởng và phát triển ở các pH môi trường khác nhau.
Để xác định pH thích hợp cho các chủng nấm nghiên cứu, chúng tôi sử dụng môi trường MT 1 dịch thể được điều chỉnh ở các mức pH khác nhau: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 7,5; 8,0; 8,5 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N để nuôi cấy hai chủng nấm nghiên cứu.
Sau thời gian nuôi cấy 5 ngày ở nhiệt độ phòng, lọc thu sinh khối để cân và dịch lên để thử hoạt tính KS bằng phương pháp đục lổ.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính ĐK của chủng T.
cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
pH Sinh khối (g) Hoạt tính ĐK (D-d,mm)
T. cf.aureoviride ĐB108 T. cf.aureoviride ĐB108 3.5 0,33 0,36 26,00 30,70 4.0 0,34 0,37 25,80 31,30 4.5 0,32 0,42 26,30 28,70 5.0 0,40 0,47 26,00 32,30 5.5 0,38 0,39 26,30 29,00 6.0 0,36 0,43 28,00 30,00 6.5 0,44 0,45 27,30 27,00 7.0 0,42 0,36 26,50 32,50 7.5 0,39 0,40 25,30 28,30
8.0 0,40 0,46 24,50 28,00
8.5 0,33 0,42 24,00 28,30
Hình 3.20. Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Hình 3.21. Đồ thị ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Kết quả cho thấy chủng T. cf.aureoviride và có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS ở môi trường có phổ pH tương đối rộng, hoạt tính KS thể hiện khá từ pH = 3 đến 7,5; hoạt tính KS đạt cực đại ở pH = 6,0; chủng đột biến cũng có phổ pH cho quá trình sinh trưởng và sinh tổng
hợp CKS rộng và đạt cực đại ở pH = 7,0. Tuy nhiên, quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của chủng này không ổn định như ở chủng ban đầu, điều này có thể do mức độ ổn định của chủng đột biến chưa cao. Giá trị pH các chủng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS như trên là phù hợp với giá trị pH thích hợp cho nấm sợi là từ khoảng 3 – 6 (Theo Nguyễn Đức Lượng, 2004)
f/ Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS
Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng đến cường độ phát triển của VSV cũng như của NS. Mỗi loại VSV có đều có nhiệt độ phát triển phù hợp.
Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh CKS của các chủng
Trichoderma nghiên cứu, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng này trong môi trường MT
1 dịch thể ở các nhiệt độ khác nhau: 20, 23, 26, 29, 31, 33, 360
C trong thời gian 5 ngày. Đối chứng được để ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian nuôi, lọc thu sinh khối để cân và dịch lên để thử hoạt tính KS .
Kết quả được trình bày trong bảng 3.8
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ khác nhau đến khả năng sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Nhiệt độ (oC)
Sinh khối (g) Hoạt tính KS (D-d,mm)
T. cf.aureoviride ĐB108 cf.aureoviride T. ĐB108 Đối chứng (nhiệt độ phòng) 0,43 0,51 30,57 32,57 20 0,23 0,19 28,12 30,00 23 0,25 0,27 29,43 31,17 26 0,38 0,28 31,74 34,17 29 0,42 0,42 31,91 29,75 31 0,51 0,58 27,67 30,83 33 0,47 0,63 16,67 28,00 36 0,21 0,19 0,00 0,00
Hình 3.22. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Hình 3.23. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp CKS của chủng
T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Từ biểu đồ và đồ thị trên cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp CKS của 2 chủng đều tương đối giống nhau. Nhiệt độ thích hợp cho chủng ban đầu là từ 26 – 30o
C, chủng đột biến ĐB108 là khoảng từ 23 – 28o
C. Nguyên nhân do chủng gốc sống trong MT tự nhiên của rừng ngập mặn cần Giờ, nơi có nhiệt độ trung bình trong năm
từ 24 - 27oC. Đối với chủng đột biến, điểm tối ưu về nhiệt độ là 26oC, đây là nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của các loài vi nấm.
3.3. Động học của quá trình lên men sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108
Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi chọn môi trường MEA (nguồn cacbon là galactose, nguồn nitơ là bột đậu nành, nồng độ muối là 3,0%, pH môi trường là 6,0, nhiệt độ nuôi cấy là 290C) để nuôi cấy chủng T. cf.aureoviride; chọn môi trường PGA với nguồn