L ỜI CẢM ƠN
3.1.1.Đặc điểm của chủng Trichoderma cf.aureoviride
4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1.Đặc điểm của chủng Trichoderma cf.aureoviride
a/ Hình thái:
Chủng Trichoderma cf.aureoviride được nuôi cấy chấm điểm trên môi trường thạch
MT1, ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 – 7 ngày. Quan sát sự phát triển của khuẩn lạc chủng NS nghiên cứu nhận thấy:
Khuẩn lạc tròn, lúc đầu màu trắng sau chuyển sang màu xanh lục. Bề mặt khuẩn lạc xốp, mép KL hình tia, không xuất hiện giọt tiết. Tốc độ phát triển của khuẩn lạc nhanh, đường kính KL đạt 8cm sau 3 ngày, sau thời gian 5-6 ngày khuẩn lạc mọc kín mặt đĩa petri. Mặt trái KL không tiết sắc tố.
A B
Hình 3.1. Hình thái đại thể chủng T. cf.aureoviride
(A: mặt trên, B: mặt dưới KL sau 7 ngày)
Khuẩn ty không màu, phân nhánh, có vách ngăn, không có tế bào màng dày, kích thước của khuẩn ty tương đối đồng đều.
Cuống sinh bào tử ngắn, phân nhánh, bào tử trần liên kết. Bào tử hình cầu, màu xanh xuất phát từ đầu trên thể bình, không màu, tập hợp thành các khối tròn ở miệng thể bình, không nhày.
Hình 3.2. Hình thái vi thể của chủng T. cf.aureoviride
b/ Khả năng sinh CKS
Chủng ban đầu T. cf.aureoviride được nuôi cấy trên môi trường lỏng MT 2 đã vô trùng sau thời gian 5 ngày lọc để thu sinh khối và dịch lên men.
Kết quả khảo sát sinh trưởng của chủng này là 0,4g và hoạt tính ĐK với B.subtilis là
rất mạnh (25,0 mm).
Hình 3.3. Hoạt tính ĐK với B. subtilis của chủng gốc T. cf.aureoviride 3.1.2. Kết quả gây đột biến chủng T. cf.aureoviride bằng tia tử ngoại
Chủng T. cf.aureoviride được gây đột biến bằng tia tử ngoại theo phương pháp 2.2.1.
Sau khi gây đột biến, tiến hành thu các khuẩn lạc mọc trên đĩa petri (sau đây tạm gọi mỗi khuẩn lạc là một chủng sau đột biến). Qua 4 lần gây đột biến, tổng cộng thu được 75 chủng khác nhau.
Các chủng này được tiến hành kiểm tra lại hoạt tính kháng sinh để xác định tác động của tia UV trên chủng gốc.
Từ 75 chủng, sau khi kiểm tra hoạt tính nhận thấy có 40 chủng hoạt tính kháng sinh thay đổi và có đến 27 chủng mất hoạt tính kháng sinh (D - d = 0 mm) chiếm tỉ lệ 40,3%.
Kết quả ảnh hưởng của tia tử ngoại đối với chủng T. cf.aureoviride được tóm tắt trong bảng 3.1. như sau:
Bảng 3.1. Tổng hợp ảnh hưởng của tia tử ngoại đến hoạt tính kháng sinh của các chủng STT Thời gian tác động Số lượng chủng thu được Số lượng chủng mất hoạt tính Số lượng chủng có hoạt tính tăng Số lượng chủng có hoạt tính giảm 1 2 phút 16 7 5 4 2 4 phút 14 5 1 8 3 6 phút 18 8 0 10 4 8 phút 15 8 0 7 5 10 phút 12 7 3 2 6 Tổng cộng 75 35 9 31
Bảng 3.2. Khả năng đối kháng VSV kiểm định của các chủng đột biến và chủng gốc
STT Thời gian tác
động Ký hiệu chủng E. coli Hoạt tính KS (D-d,mm) B. subtilis
Đối chứng T. cf.aureoviride - 25 1 2 phút ĐB223 - 23 2 ĐB228 - 11 3 ĐB224 - 21 4 ĐB225 - 21 5 ĐB227 - 17 6 ĐB2.23 - 29 7 ĐB2.22 - 29 8 ĐB2.210 - 27 9 ĐB2.27 - 28 1 4 phút ĐB241 - 13 2 ĐB242 - 19 3 ĐB2.41 - 24 4 ĐB2.42 - 27 5 ĐB2.43 - 17 6 ĐB2.44 - 18 7 ĐB2.46 - 24 8 ĐB2.47 - 21 9 ĐB2.49 - 15 1 6 phút ĐB261 - 22 2 ĐB263 - 18 3 ĐB264 - 20 4 ĐB267 - 11 5 ĐB2611 - 08 6 ĐB2612 - 14 7 ĐB2613 - 15 8 ĐB2616 - 23 9 ĐB2618 - 20 10 ĐB2619 - 19 1 8 phút ĐB281 - 19 2 ĐB282 - 21 3 ĐB283 - 07 4 ĐB284 - 13 5 ĐB285 - 14 6 ĐB286 - 17 7 ĐB287 - 23 1 10 phút ĐB101 - 23 2 ĐB102 - 22 3 ĐB108 0.4 32 4 ĐB104 - 24 5 ĐB106 - 25
Qua kiểm tra khả năng đối kháng của các chủng đối với VSV kiểm định, chủng ĐB108 có hoạt tính ĐK với B.subtilis thay đổi theo chiều hướng tăng cao nhất (32,0mm), hoạt tính ĐK này mạnh hơn chủng gốc ban đầu là T. cf.aureoviride (25,0mm). Mặt khác,
chủng này còn xuất hiện khả năng đối kháng E.coli nhưng ở mức yếu. Do đó, trong các chủng đột biến, chọn chủng ĐB108 cùng với chủng ĐB2.23 cũng là chủng có hoạt tính tăng so với chủng gốc (29,0mm so với 25,0mm) và chủng ĐB283 - là chủng có đặc điểm hình thái KL biến đổi rõ ràng - để khảo sát đặc điểm hình thái của chúng.
@ Đặc điểm hình thái chủng ĐB108:
Để nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng ĐB108, tiến hành nuôi cấy chủng này trên môi trường thạch MT1, ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 – 7 ngày, quan sát sự phát triển của khuẩn lạc.
Khuẩn lạc chủng ĐB108 có hình tròn, lúc đầu màu trắng sau chuyển sang màu xanh lục nhạt. Bề mặt khuẩn lạc cũng có dạng xốp, phát triển thành những vòng tròn đồng tâm, mép KL hình tia, trên bề mặt khuẩn lạc không xuất hiện giọt tiết. Tốc độ phát triển của khuẩn lạc nhanh, đường kính KL đạt 7-8 cm sau 3 ngày, sau thời gian 5-6 ngày khuẩn lạc mọc kín mặt đĩa petri. Chủng ĐB108 không tiết sắc tố.
A B (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.4. Hình thái đại thể chủng ĐB108
(A: mặt trên B: mặt dưới sau 6 ngày)
Sợi nấm chủng ĐB108 có vách ngăn, phân nhánh, khuẩn ty không màu, không có tế bào màng dày, kích thước của khuẩn ty tương đối đồng đều.
Cuống sinh bào tử ngắn, phân nhánh, bào tử trần liên kết. Bào tử hình cầu, màu xanh xuất phát từ đầu trên thể bình, không màu, tập hợp thành các khối tròn ở miệng thể bình, không nhày.
Hình 3.5. Hình thái vi thể chủng ĐB108
Khả năng sinh CKS của chủng ĐB108 thể hiện qua khảo sát hoạt tính kháng sinh cao hơn nhiều so với chủng ban đầu, đạt kích thước vòng vô khuẩn là 32,0mm, chủng ban đầu là 25,0mm.
@ Đặc điểm hình thái chủng ĐB2.23
Khuẩn lạc chủng ĐB2.23 lúc đầu có màu trắng, hình tròn, về sau chuyển sang màu xanh lục nhạt. Tốc độ phát triển của khuẩn lạc nhanh, đường kính KL đạt 6,5-7cm sau 3 ngày, khuẩn lạc sau thời gian 5-6 ngày đã mọc kín mặt đĩa petri. Chủng này cũng không hình thành sắc tố.
Bề mặt khuẩn lạc cũng có dạng xốp, phát triển thành những vòng tròn đồng tâm, mép KL hình tia, trên bề mặt khuẩn lạc không xuất hiện giọt tiết.
So với chủng T. cf.aureoviride ban đầu, chủng ĐB2.23 không có nhiều sai khác về hình thái. Về năng suất sinh tổng hợp CKS, chủng này có hoạt tính rất cao (29,0mm), cao hơn so với 25,0mm của chủng ban đầu.
A B
Hình 3.6. Hình thái đại thể chủng ĐB2.23
(A: mặt trên, B: mặt dưới)
Hình 3.7. Hình thái vi thể chủng ĐB2.23 @ Đặc điểm hình thái chủng ĐB283
Khuẩn lạc chủng ĐB 283 có tốc độ phát triển chậm, sau thới gian 6 ngày khuẩn lạc chưa bao phủ hết đĩa petri. Bề mặt khuẩn lạc lồi lõm, nhiều vùng không đồng nhất về màu, từ màu trắng đến màu xanh lục đều có trên bề mặt khuẩn lạc. mép khuẩn lạc hình tia, không đồng đều. không xuất hiện sắc tố và giọt tiết.
A B
Hình 3.8. Hình thái đại thể chủng ĐB283
(A: mặt trên ,B: mặt dưới sau 6 ngày)
Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, không có màng dày. Cuống sinh bào tử ngắn, bào tử hình elip, một mặt lõm vào, màu lục nhạt.
A B
Hình 3.9. Hình thái vi thể chủng ĐB283
(A: khuẩn ty, B: bào tử)
So với chủng T. cf.aureoviride ban đầu, chủng ĐB283 là chủng có nhiều sự sai khác về hình thái KL, hình dạng bào tử. Tuy nhiên, năng suất sinh tổng hợp CKS của chủng này giảm rất nhiều so với chủng ban đầu (7,0mm so với 25,0mm).
Sau khi khảo sát đặc điểm hình thái và hoạt tính ĐK của các chủng. Chủng ĐB108 có sự thay đổi khả năng sinh CKS theo chiều dương, chủng này được chọn trong các chủng đột biến để khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh CKS cùng với chủng gốc T. cf.aureoviride.
3.2. Khảo sát các điều kiện MT ảnh hưởng đến hoạt tính kháng sinh của các chủng chủng
a/ Ảnh hưởng của MT đến khả năng sinh tổng hợp CKS
Các loại môi trường khác nhau có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của các chủng NS.
Để xác định môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng cũng như hoạt tính đối kháng của các chủng NS nghiên cứu, chúng tôi tiến hành nuôi cấy hai chủng này trên các loại môi trường khác nhau trong thời gian là 5 ngày.
Sau đó, thu sinh khối và dịch KS thô. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính kháng sinh của chủng T. cf.aureoviride và chủng ĐB108 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trường
Sinh khối (g) Hoạt tính KS (D-d,mm)
T. cf.aureoviride ĐB108 cf.aureoviride T. ĐB108 MT 1 0,45 0,47 19,00 23,00 MT 2 0,43 0,53 26,00 26,40 MT 3 0,51 0,38 10,30 22,80 YEA 0,67 0,51 22,00 25,00 MEA 0,73 0,70 30.50 30,00 PGA 0,83 0,85 29,00 35,00 D 0,58 0,43 19,00 21,00 Czapek 0,27 0,50 10,00 13,00 Czapek- Dox 0,32 0,30 20,00 13,00
Hình 3.10. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính KS của chủng
T. cf.aureoviride
Hình 3.11. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính KS của chủng ĐB108
Hình 3.12. Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng của chủng
T. cf.aureoviride và chủng ĐB108
Qua kết quả trên cho ta thấy chủng T. cf.aureoviride sinh trưởng tốt nhất trong môi trường PGA và có hoạt tính đối kháng cao nhất trong môi trường MEA, đối với chủng ĐB108, trong môi trường PGA thì quá trình sinh trường và hoạt tính KS cao nhất. Môi trường PGA chứa nguồn cacbon là tinh bột phù hợp cho sinh trưởng của cả hai chủng nên trong MT này chúng đều có khả năng sinh trưởng cao nhất. Ngoài ra, trong MT này còn chứa nhiều hợp chất phù hợp cho sinh trưởng của hai chủng như các vitamin trong khoai tây. Tuy nhiên, khả năng hình thành CKS của mỗi chủng khác nhau, có thể các chất trong
cao malt và pepton phù hợp cho chủng gốc T. cf.aureoviride tạo CKS và chủng ĐB108 thích hợp với chất có nguồn gốc từ khoai tây.
Hình 3.13. Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính ĐK của chủng
T. cf.aureoviride và chủng ĐB108
b/ Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của 2 chủng NS
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như NS, cacbon tham gia trong hầu hết các cấu trúc của tế bào. Các hợp chất cung cấp cacbon có ý nghĩa quan trọng hàng đầu đối với sự sống của tế bào VSV.
Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của các chủng nghiên cứu, tiến hành nuôi cấy chủng T. cf.aureoviride trên môi trường MEA, chủng ĐB108 được nuôi cấy trên môi trường PGA nhưng nguồn cacbon được thay thế lần lượt là CMC, succrose, fructose, glucose, rỉ đường, maltose, galactose, lactose, tinh bột.
Sau thời gian nuôi cấy 5 ngày, lọc dịch nuôi cấy. Thu sinh khối, cân để xác định khả năng sinh trưởng và thử hoạt tính ĐK bằng phương pháp đục lổ.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau đến sinh trưởng và sinh CKS của
T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108 Nguồn
cacbon
Sinh khối (g) Hoạt tính KS (D-d,mm)
T. cf.aureoviride ĐB108 cf.aureoviride T. ĐB108 CMC 0,52 0,35 30,00 26,00 Succrose 0,41 0,46 27,00 32,00 Fructose 0,50 0,50 31,00 31,00 Glucose 0,37 0,51 30,50 31,30 Rỉ đường 0,44 0,45 33,00 37,00 Maltose 0,34 0,43 28,80 32,00 Galactose 0,42 0,45 34,00 32,70 Lactose 0,39 0,45 31,50 33,00 Tinh bột 0,42 0,49 30,00 30,30
Hình 3.14. Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng của chủng
T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Biểu đồ trên chỉ ra rằng các nguồn cacbon khác nhau đều thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108. Tuy nhiên, ở chủng ban đầu nguồn CMC cho sinh khối cao hơn so với các nguồn cacbon khác, ở chủng ĐB108 thì nguồn cacbon glucose cho sinh khối cao hơn các loại cacbon còn lại. Do chủng ban đầu sống trong môi trường rừng ngập mặn nên nguồn cacbon là CMC (celullose) phù hợp hơn các nguồn cacbon là đường chuẩn khác. Ở chủng đột biến, có sự thay đổi về đặc điểm sinh hóa nên glucose trở nên thích hợp cho sinh trưởng của chủng này.
Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Hoạt tính kháng sinh của chủng đột biến ĐB108 và chủng ban đầu T. cf.aureoviride
thay đổi ít theo nguồn cacbon. Điều này phù hợp với kết quả sinh trưởng của hai chủng, cũng như nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp (2010) về sự phát triển và hình thành sản phẩm trao đổi chất bậc hai của Trichoderma trên các nguồn cacbon khác nhau.
Theo kết quả trên đồ thị, chủng T. cf.aureoviride có hoạt tính KS mạnh nhất khi phát triển trong MT có nguồn cacbon là galactose, chủng ĐB108 có hoạt tính KS mạnh nhất đối với nguồn cacbon là rỉ đường, điều này được giải thích là do rỉ đường có nhiều thành phần khác như các vitamine, khoáng chất cần thiết cho việc trao đổi chất, hình thành chất KS của chủng này.
Do đó, trong các thí nghiệm khảo sát hoạt tính ĐK của các chủng NS tiếp theo, chúng tôi sử dụng galactose là nguồn cacbon cho chủng ban đầu T. cf.aureoviride và sử dụng rỉ đường cho chủng đột biến ĐB108.
c/ Ảnh hưởng của độ mặn môi trường đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của 2 chủng NS (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khả năng chịu mặn là đặc điểm quan trọng của các chủng NS rừng ngập mặn. Để khảo sát ảnh hưởng của yếu tố này đến sự sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của 2 chủng NS nghiên cứu, chúng tôi nuôi cấy chủng T. cf.aureoviride trong môi trường MEA và chủng
ĐB108 trong môi trường PGA có độ mặn thay đổi từ 0,0%; 2,0%; 2,5%; 3,0%; 3,5%; 4,0%; 4,5%; 5,0%; 5,5%.
Sau thời gian nuôi cấy 5 ngày, lọc thu dịch lên men, cân sinh khối và thử hoạt tính KS bằng phương pháp đục lỗ.
Kết quả sinh trưởng và hoạt tính ĐK được trình bày trong bảng 3.5
Bảng 3.5. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS ở các độ mặn khác nhau
Độ mặn (NaCl,%)
Sinh khối (g) Hoạt tính ĐK (D-d,mm)
T. cf.aureoviride ĐB108 cf.aureoviride T. ĐB108 0,0 0,40 0,83 18,00 21,0 2,0 0,42 0,92 19,00 15,00 2,5 0,58 0,93 21,00 9,00 3,0 0,60 0,74 22,00 5,00 3,5 0,80 0,72 11,00 7,00 4,0 0,65 0,41 0,00 2,00 4,5 0,66 0,50 0,00 0,00 5,0 0,58 0,58 0,00 0,00 5,5 0,42 0,55 0,00 0,00
Hình 3.16. Biểu đồ ảnh hưởng của độ mặn môi trường đến khả năng
sinh trưởng của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Hình 3.17. Ảnh hưởng của độ mặn môi trường đến khả năng hình thành CKS của chủng T. cf.aureoviride và chủng đột biến ĐB108
Qua đồ thị chúng ta nhận thấy, ở chủng ban đầu, hoạt tính tăng khi nồng độ muối tăng từ 0,0% đến 3,0%. Từ nồng độ NaCl 3,5% trở đi, hoạt tính KS của chủng giảm mạnh, ở 4,0% hoạt tính KS của chủng mất hoàn toàn. Điều này phù hợp vì chủng này được phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ nơi đây thường xuyên có nước biển lên xuống theo thủy triều, nồng độ muối môi trường cũng thường dao động quanh giá trị 3,0-4,0%. Khả năng sinh trưởng của chủng gốc kém khi nồng độ NaCl thấp, khi độ mặn tăng dần thì quá trình sinh trưởng của chủng này tăng, sinh khối của chủng đạt cao nhất khi nồng độ muối là 3,5%.
Đối với chủng đột biến, hoạt tính kháng sinh thể hiện cao nhất ở nồng độ 0,0% do đột biến làm mất đi khả năng chịu mặn của chủng ĐB108 so với chủng gốc. Hoạt tính của chủng ĐB108 giảm dần khi nồng độ muối tăng, từ nồng độ 4,5% chủng mất hoạt tính KS, giá trị này cao hơn so với chủng ban đầu.
Độ mặn của môi trường nuôi cấy nấm sợi có ảnh hưởng khác nhau đến sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp CKS của cả hai chủng NS nghiên cứu. Đối với chủng T.
cf.aureoviride, giá trị nồng độ NaCl trong môi trường thích hợp cho sinh trưởng và sinh
đổi rất lớn. Điều này có thể giải thích do tác động của tia UV làm thay đổi đặc tính của