PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

L ỜI CẢM ƠN

2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1. Khảo sát đặc điểm hình thái nấm sợi và định danh nấm sợi [5]

a/ Quan sát đại thể nấm sợi (Phương pháp tạo KL khổng lồ)

Nuôi cấy NS trên ống thạch nghiêng trong thời gian 5 ngày.

Cho vào ống thạch nghiêng chứa 5 ml nước cất vô trùng, lắc đều để tạo dung dịch huyền phù.

Dùng que cấy chấm vào dịch huyền phù, sau đó nhanh chóng chấm điểm lên mặt thạch ở giữa đĩa pêtri chứa MT 2.

Quan sát sự hình thành và phát triển của KL dựa trên các đặc điểm sau:

- Hình thái, kích thước (đường kính) khuẩn lạc.

- Dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay không…), màu sắc mặt trên và mặt dưới, dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…)

- Giọt tiết nếu có (nhiều, ít, màu sắc), mùi khuẩn lạc (có, không mùi), sắc tố hoà tan (màu của môi trường xung quanh khuẩn lạc) nếu có.

- Các cấu trúc khác: bó sợi, bó giá (Synnematous or sporodochial conidiomata) các cấu trúc mang bào tử trần (Fruit body - conidiomata) như đĩa giá (acervuli) hoặc túi giá (Pycnidia), đệm nấm (Stroma), hạch nấm (sclerotia) vv..

b/ Quan sát vi thể nấm sợi (Phương pháp làm phòng ẩm) [4], [5]

Chuẩn bị môi trường thạch YEA, đổ 1 lớp thật mỏng khoảng 1mm trên bề mặt đĩa pêtri. Khi thạch đã đông hoàn toàn thì dùng dao vô trùng cắt thành từng mẩu hình vuông, diện tích 1 cm2.

Chuẩn bị các đĩa pêtri chứa phiến kính, lamen, giấy thấm vô trùng ở nhiệt độ 1600C trong 2 giờ và các ống nước cất vô trùng.

Đặt 1 mẩu thạch lên phiến kính, cấy ít bào tử lên góc của khối thạch. Đậy lamen lại, làm ẩm giấy vô trùng trong các hộp pêtri bằng nước cất chuẩn bị sẵn. giữ các hộp pêtri ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 ngày.

Sau thời gian nuôi giữ 2 ngày, khẽ gỡ lamen ra, úp lên 1 phiến kính sạch có bề mặt thuốc nhuộm. gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lamen lên trên. Quan sát tiêu bản ở vật kính x40, x100 và mô tả các đặc điểm sau:

- Sợi nấm có phân nhánh hay không, sợi nấm có hay không có vách ngăn.

- Giá bào tử, các thể bọng, thể bình.

- Màu sắc, hình dạng, kích thước bào tử, bào tử có gai hay không có gai. Chụp hình kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1000 lần.

2.4.2. Phương pháp gây đột biến

a/ Nguyên tắc chung

Khi được chiếu dưới đèn UV thì bào tử đang nảy mầm của nấm sợi sẽ bị đột biến.

b/ Cách tiến hành

Chủng gốc Trichoderma được nuôi cấy trên MT 2 trong 5 ngày.

Cho vào ống giống 10ml nước cất vô trùng, lăn nhẹ trên tay để cho các bào tử thấm nước và tạo thành dịch huyền phù.

Dùng pipet vô trùng hút 2ml dịch huyền phù cho vào bình tam giác chứa 50ml MT 1 dịch thể. Nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng từ 8 -10 giờ.

Ly tâm dịch nuôi cấy, thu cặn sau ly tâm. Cho vào mỗi ống ly tâm 10ml dung dịch Tween-20 0,2%, NaCl 0,09% để tạo thành dịch huyền phù. Dùng que cấy thẳng nhúng vào dịch huyền phù, sau đó cấy thành một hình tam giác lên đĩa petri chứa môi trường thạch MT 1.

Sau thời gian 4 giờ, quan sát kiểm tra trên kính hiển vi, khi bào tử bắt đầu nảy mầm thì các đĩa petri được đặt dưới đèn UV ở khoảng cách 20cm trong thời gian là 2 phút, 4 phút, 6 phút, 8 phút, 10 phút.

Các đĩa sau khi đặt dưới đèn UV trong thời gian như trên sẽ được ủ 2 – 4 ngày ở nhiệt độ phòng. Cấy chuyền các khuẩn lạc mọc được để kiểm tra, so sánh hoạt tính với chủng gốc.

2.4.3. Kiểm tra khả năng sinh chất kháng sinh

a/ Nguyên tắc chung

CKS được hình thành trong môi trường nuôi cấy NS sinh CKS sẽ ức chế tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn trên đĩa petri chứa các VSV đó. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Phương pháp đục lổ

Chủng NS nghiên cứu được nuôi cấy trên MT 2 trong 5 ngày.

Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nấm nghiên cứu cho vào bình tam giác chứa 50ml môi trường lỏng MT 4 đã vô trùng.

Nuôi cấy bình tam giác trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng.

Ly tâm 20ml dịch nuôi cấy ở 3000 vòng/phút trong 20 phút. Loại bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng. Điều chỉnh pH của dịch thu được về trung tính (6-7).

Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các lổ thạch trên môi trường có chứa các VSV kiểm định. Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch chiết chất kháng sinh thô vào các lổ khoan.

Đặt các mẫu trong tủ lạnh từ 4-6 giờ, sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ phòng.

Xác định hoạt tính kháng sinh bằng cách đo vòng vô khuẩn sau thời gian 22-24 giờ.

- Phương pháp khoanh giấy lọc

Chủng NS nghiên cứu được nuôi cấy trên MT 2 trong 5 ngày.

Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nấm nghiên cứu cho vào bình tam giác chứa 50ml môi trường lỏng MT 4 đã vô trùng.

Nuôi cấy bình tam giác trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng.

Thu dịch lên men bằng cách lọc tách sinh khối. Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch chiết chất kháng sinh thô cho vào khoanh giấy lọc vô trùng có đường kính 1cm, để khô tự nhiên hoặc sấy khô ở điều kiện không quá 500

C .

Đặt các khoanh giấy lọc có tẩm dịch lên men lên các đĩa petri đã cấy trải VSV kiểm định.

Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4-6 giờ, sau đó ủ mẫu ở nhiệt độ phòng. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng cách đo vòng vô khuẩn sau thời gian 22-24 giờ.

c/ Kiểm tra kết quả

Hoạt tính kháng sinh = (D – d) mm

Trong đó: D - đường kính vòng phân giải, d - đường kính lổ thạch (D – d) ≥ 25mm : hoạt tính rất mạnh

(D – d) ≥ 20mm : hoạt tính mạnh (D – d) ≥ 10-19,5mm : hoạt tính trung bình (D – d) ≤ 10mm : hoạt tính yếu

a/ Nguyên tắc chung

Khả năng sinh trưởng của NS được thể hiện bằng việc tăng sinh khối của chúng trong môi trường nuôi cấy.

b/ Cách tiến hành

Chủng NS nghiên cứu được nuôi cấy trên MT 2 trong 5 ngày.

Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng nấm nghiên cứu cho vào bình tam giác chứa 50ml môi trường lỏng MT 4 đã vô trùng.

Nuôi cấy bình tam giác trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng.

Giấy lọc được sấy đến khối lượng không đổi, cân khối lượng giấy lọc (M1).

Lọc dịch nuôi cấy, sinh khối NS được giữ lại trên giấy lọc, sấy đến khi khối lượng không đổi, cân lần 2 (M2).

c/ Kiểm tra kết quả

Xác định khả năng sinh trưởng của NS dựa vào sự tăng trưởng của sinh khối khi nuôi cấy: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

∆M = M2 – M1

2.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính kháng sinh của các chủng Trichoderma

a/ Nguyên tắc chung

Mức độ phát triển và hoạt tính chất kháng sinh của nấm sợi thể hiện ảnh hưởng của điều kiện khác nhau của môi trường.

b/ Cách thực hiện

• Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon

Để khảo sát khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của các chủng nấm nghiên cứu chúng tôi sử dụng môi trường MT 1 nhưng glucose lần lượt được thay thế bằng các nguồn hydrat cacbon khác nhau: lactose, sucrose, fructose, maltose, tinh bột, CMC, rỉ đường với trọng lượng như nhau.

Mẫu đối chứng được nuôi ở môi trường MT 1.

Cấy chấm điểm các chủng nghiên cứu lên bề mặt môi trường tương ứng, sau đó để trong tủ ấm 4 ngày.