Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt các yếu tố như tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp.
Đối với phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens thì tần số biến nạp phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn và các yếu tố liên quan đến thực vật. Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn gồm: chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm nhập vào các câu chủ và loại vector.
- Ảnh hưởng của kiểu gen: nhìn chung, hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một loài. Đa số các báo cáo, tài liệu về chuyển gen chỉ đề cập đến ảnh hưởng của kiểu gen đến khả năng chuyển T-ADN hay phản ứng nuôi cấy
in vitro.
- Ảnh hưởng của dạng mẫu mô đích: các dạng mô được sử dụng làm mô đích để biến nạp là mô sẹo phôi hóa, phôi non của hạt hay huyền phù tế bào. Mẫu quá non hay quá già đều ảnh hưởng đến khả năng biến nạp. Nếu mẫu non, sức sống kém dẫn đến tỷ lệ mẫu sống thấp, còn nếu mẫu quá già lúc này hệ gen thực vật ổn định dẫn đến việc tiếp nhận gen ngoại lai trở nên khó khăn hơn.
- Ảnh hưởng của chủng Agrobacterium và plasmid: Các nghiên cứu chuyển gen thành công thông qua A.tumefaciens cho thấy hiện tại chỉ có 3 chủng vi khuẩn được sử dụng hiệu quả ở các loài cây một lá mầm đó là LBA4404, C58 đã bị bất hoạt và EHA101 và các chủng cải biên (EHA105 từ EHA101, AGL0 và AGL1 từ EHA101) [15]. Dạng Ti-plasmid của Agrobacterium cũng có vai trò trong quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Các nghiên cứu cho thấy, Ti-plasmid dạng nopalin có hiệu quả hơn trong việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với Ti- plasmid dạng octopin.
- Nhiệt độ: Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển T-ADN đã được phát hiện ở các loài cây hai lá mầm. Nhiệt độ thích hợp
định. Nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen bền vững cũng cần phải được đánh giá với mỗi dạng mẫu mô đích và với mỗi chủng Agrobacterium biến nạp. Ở các loài cây một lá mầm nhiệt đồng nuôi cấy thường là 24-250C, một số trường hợp là 280C. Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp (dưới 230C) đến khả năng chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững đã được đánh giá. Biểu hiện gen bền vững gen gus tạm thời trong chuyển gen vào mô sẹo cây tỏi đạt được cao nhất ở 220C. Tần số chuyển gen cao hơn đã nhận được ở phôi ngô non sau biến nạp được đồng nuôi cấy ở 200C so với 230C [18].
- Ảnh hưởng của thành phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy: Thành phần môi trường cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiêu quả chuyển gen.
Việc bổ sung AS chất kích thích sự hình thành các gen vir, đã có trong hầu hết các quy trình chuyển gen ở cây một lá mầm. Trong trường hợp không có AS, mức độ biểu hiện tạm thời của gen gus rất thấp, không tái sinh được cây lúa và cây hành chuyển gen.
Gần đây, việc sử dụng L-Cys bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy đã cải thiện hiệu suất chuyển gen của 3 dòng ngô [18].
- Ảnh hưởng của các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium: Các chất kháng sinh như: cefotaxime, Car, timentin thường được sử dụng loại bỏ vi khuẩn sau khi đồng nuôi cấy trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua Agrobacterium [32]. Hiện nay, Car đang được sử dụng chủ yếu trong các thí nghiệm chuyển gen thông qua Agrobacterium vào ngô và lúa ở nồng độ 100 mg/ [15]. Và đối với đậu tương là Cefotaxime 200mg/l, Car 250mg/l [31].
- Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn: Mật độ vi khuẩn Agrobacterium cao thường gây chết tế bào thực vật giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển gen bền vững. Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần thiết đối với chuyển gen vào các loài, các mẫu mô khó, tần số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm thời gian ngắn, rửa mẫu sau khi lây nhiễm hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường đồng nuôi cấy [38].
Trong hầu hết các trường hợp, nếu quá trình chuyển T-ADN hiệu quả sẽ dẫn đến khả năng chuyển gen bền vững cao. Mặc dù vậy, trong nhiều điều kiện quá trình chuyển T-ADN tăng đã không có kết quả trong chuyển gen bền vững. Nguyên nhân có thể là do thiếu sự tương tác giữa quá trình chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững. Để có được sự phối hợp giữa chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững thì các
điều kiện lây nhiễm, đồng nuôi cấy phải thích hợp cho việc chuyển T-ADN và tái sinh cây chuyển gen [15].