Tỷ lệ mẫu sống (%) =
Tổng số mẫu sống
x 100% Tổng số mẫu ban đầu
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm x 100%
Tổng số mẫu ban đầu
Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết x 100%
Tổng số mẫu ban đầu
Tần số chuyển gen (%) = Tổng số mẫu có đốm xanh x 100% Tổng số mẫu đã nhuộm
Chương III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu
Giai đoạn tạo nguồn nguyên liệu vô trùng ban đầu là giai đoạn đưa đối tượng nuôi cấy từ ngoài vào điều kiện nuôi cấy in vitro, vì vậy việc xác định phương thức khử trùng thích hợp có ý nghĩa quyết định đối với thành công của quá trình nuôi cấy
in vitro. Giai đoạn này cần đạt được các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại, phân hóa và sinh trưởng tốt.
Tỷ lệ vô trùng thành công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm nhâp của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mẫu, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô mẫu. Dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.
Chúng tôi sử dụng nguồn mô ban đầu để tạo nguyên liệu vô trùng trong ống nghiệm là từ các hạt đậu tương giống ĐT26 đã đủ điều kiện làm giống và được thu hoạch từ ngoài đồng ruộng vào nên hạt bị nhiễm nhiều các loại vi khuẩn, nấm từ môi trường đất, từ quá trình thu hoạch,…Trước khi khử trùng mẫu bằng NaClO, chúng tôi rửa mẫu bằng ethanol 70% trong 3 phút để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của NaClO, sau đó mẫu mới được rửa bằng NaClO theo các nồng độ và thời gian như bảng 6.
Sau khi lắc bằng ethanol 70% trong 3 phút thì rửa lại mẫu 1 lần với nước cất và tiếp tục lắc mẫu với NaClO, cuối cùng mẫu được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (5-6 lần). Dùng dao và panh tách lớp vỏ của hạt và cấy lên môi trường MS trong 2-3 ngày.
Tỷ lệ mẫu sống và sạch khuẩn, nấm trong môi trường MS là các chỉ tiêu đánh giá kết quả khử trùng.
Bảng 6. Nồng độ và thời gian khử trùng của Ethanol và NaClO Ethanol Nồng độ (%) 70 Thời gian (phút) 3 NaClO Nồng độ (%) 10 12,5 15 20 Thời gian (phút) 5 10 13,5 5 10 13,5 5 10 13,5 5 10 13,5 Sau hai tuần, kết quả theo dõi được như ở bảng 7 với tổng số mẫu đã làm với từng thí nghiệm về thời gian và nồng độ là 120 mẫu.
Bảng 7. Kết quả thí nghiệm thử nồng độ và thời gian khử trùng
Hóa chất Nồng độ khử trùng (%) Thời gian (phút)
Tỷ lệ nhiễm (%)
Tỷ lệ chết (%)
Tỷ lệ sống (%) NaClO 10 5 37,2 25,7 37,1 10 19,5 39,7 40,8 13,5 12,4 25,8 61,8 12,5 5 43,2 12,8 44,0 10 24,7 25,3 50,0 13,5 8,4 9,5 82,1 15 5 23,9 24,8 51,3 10 18,4 15,7 65,9 13,5 3,9 8,6 87,5 20 5 4,2 46,5 49,3 10 0,08 83,4 16.52 13,5 0,0 95 5
Kết quả thí nghiệm (bảng 6 và 7) cho thấy:
- Nồng độ và thời gian khử trùng của NaClO tỷ lệ nghịch với tỷ lệ nhiễm, nhưng tỷ lệ thuận với tỷ lệ chết của mẫu.
- Nhìn vào bảng 7 thấy rằng: Ở nồng độ 20% với thời gian 10 và 13,5 phút tỷ lệ nhiễm của mẫu là rất ít hoặc tuyệt đối không nhiễm, tuy nhiên tỷ lệ chết của
- Ở nồng độ 15% và thời gian 13,5 phút tỷ lệ nhiễm của mẫu là thấp nhất, tỷ lệ sống là cao nhất và tỷ lệ chết của mẫu là phù hơp.
- Ở nồng độ 10% và 12,5% tỷ lệ nhiễm cao dẫn đến tỷ lệ mẫu chết cao do nồng độ này chưa đủ để khử sạch vi khuẩn của hạt.
- Từ đây rút ra phương thức khử trùng thích hơp nhất của giống đậu tương ĐT26 là : Ethanol 70% trong 3 phút và NaClO 15% trong 13,5 phút.
Sau 2 ngày, 87,5% mẫu sống sạch nảy mầm bình thường, khỏe mạnh.
3.2. Chuyển gen gus vào đậu tương
Sau khi thu được nguồn vật liệu ban đầu vô trùng chúng tôi bắt đầu thực hiện các thí nghiệm tối ưu để xây dựng quy trình chuyển gen vào đậu tương ĐT26.
Chúng tôi sử dụng vector pCAMBIA1301 mang gen gus là gen chỉ thị sàng lọc, gen kháng ka là gen chỉ thị chọn lọc vi khuẩn và gen kháng hygromycin là gen chỉ thị chọn lọc thực vật. Vì vậy, để xây dựng quy trình chuyển gen cần dựa vào tần số chuyển gen chính là số lượng mẫu có biểu hiện gus tạm thời trên tổng số mẫu sử dụng trong thí nghiệm.
Gen gus là gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β- glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3- indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ huyển sang màu xanh chàm đặc trưng.
Vị trí được chọn làm đích lây nhiễm là nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt theo nghiên cứu của Xue R.G. et al. [31] và Tran Thi Cuc Hoa et al. [35].