Từ các thí nghiệm từ 1-5, chúng tôi đã xây dựng được thành công quy trình tái sinh sau chuyển gen của giống đậu tương ĐT26.
- Khử trùng hạt với ethanol 70% trong 3 phút và NaClO 15% trong 13,5 phút (hình 15a), sau đó dùng dao tách bỏ lớp vỏ hạt và cấy trên môi trường MS trong 2-3 ngày (như ở hình 15b).
- Sau 2-3 ngày nảy mầm, dùng dao cắt bỏ 1 lá mầm của hạt chỉ giữ lại 1 lá mầm kèm theo nốt lá mầm. Dùng kim đâm vào vị trí nốt lá mầm của hạt với độ sâu 0,2-0,5mm, tiếp tục bỏ vào dung dịch C1 trong 30 phút, rùi chuyển sang dịch khuẩn AGL1 có OD = 0,8 với thời gian 60 phút. Tiếp tục cấy vào môi trường C2, để đồng nuôi cấy trong 5 ngày (hình 15c).
- Sau đồng nuôi cấy chuyển lên môi trường tái sinh và chọn lọc C3 trong 8 ngày (hình 15d). Tiếp tục chuyển sang môi trường nhân chồi C4 trong 21 ngày (hình 15e), rồi chuyển sang môi trường nhân chồi C5 cho đến khi chồi dài 3-5cm (hình 15f). Tiếp đó là môi trường ra rễ C5 cho đến khi mẫu ra rễ đủ khả năng sống ngoài đất (hình 15g). Cuối là chuyển cây ra môi trường đất (hình 15h).
(a) (b)
(c) (d)
Hình 15. Các bước xây dựng quy trình tái sinh đậu tương sau chuyển gen
Ghi chú: (a) – khử trùng hạt; (b)- hạt nảy mầm trong MS; (c)- đồng nuôi cẫy trong C2; (d)- chọn lọc trong C3; (e)- nhân chồi; (f)- kéo dài chồi; (g)-mẫu trong môi trường ra rễ; (h)- chuyển cây ra đất
Với tổng số mẫu ban đầu sử dụng là 300 mẫu, sau quy trình tái sinh kéo dài trong 3 tháng kết quả chúng tôi thu lại được số cây sau khi kết thúc từng giai đoạn là: nảy mầm 255 cây; đồng nuôi cấy 252 cây; tái sinh và chọn lọc 204 cây; nhân chồi 143 cây; kéo dài chồi 109 cây; ra rễ 83 cây; ra cây 56 cây; chuyển thành công ra đất 21 cây; số cây sống sót còn lại sau 1 thời gian chuyển ra đất là 2 cây. Và thu được số chồi nhân lên từ từng chồi là 2-4 chồi.
Như vậy, sau khi tiến hành quy trình chuyển gen chúng tôi thu được: - Hệ số nhân chồi 366/143 = 2,56 lần.
- Tỷ lệ cây chuyển ra đất thành công là 2/300 = 6,7x10-3 hay 0,67%
Với hệ số nhân chồi 0,33 lần, tỷ lệ chồi ra rễ là 27,7%, tỷ lệ chuyển cây ra đất thành công là 0,67%, chứng tỏ rằng chúng tôi đã tái sinh thành công đậu tương ĐT26 sau khi thực hiện quy trình chuyển gen. So sánh với các thử nghiệm đã thành công khác như Olhoft P. M. et al. đã tiến hành tiến hành thí nghiệm với giống đậu tương Bert sử dụng phương pháp nốt lá mầm và chọn lọc bằng hygromycin thu được hệ số nhân chồi là 187/82 = 2,28 lần [30]. Tran Thi Cuc Hoa et al. với giống đậu tương PC18 sử dụng phương pháp nốt lá mầm thu được kết quả là từ 1 chồi tạo được trung bình 3 chồi, tức là hệ số nhân chồi trung bình là 3 lần [35].