đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26
Sự tiếp xúc của A.tumefaciens với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã. Trong quá trình nay một chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là AS, chất này được coi là chất dẫn dụ A.tumefaciens nhận biết vị trí bị tổn thương và xâm nhập vào tế bào thực vật ở vị trí đó.
Theo nguyên tắc trên, ở thí nghiệm này chúng tôi sử dụng phương pháp làm tổn thương nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt đậu tương bằng kim. Sử dụng mẫu là nửa hạt đậu tương với nốt lá mầm đã nảy mầm 2-3 ngày, chủng vi khuẩn AGL1 có OD =0,8. Trước khi cho lây nhiễm vi khuẩn với mẫu trong 60 phút, mẫu bị làm tổn thương bằng cách dùng kim đâm trực tiếp vào vị trí nốt lá mầm với độ sâu khoảng 0,2 – 0,5mm. Sau lây nhiễm đem đồng nuôi cấy trên môi trường C2 trong 5 ngày rồi nhuộm X-gluc ở 370C trong 48h. Ở thí nghiệm này trước khi nhuộm X-gluc, dùng dao cắt bỏ phần lá mầm, chỉ giữ lại phần nốt lá mầm và 1 ít trụ dưới lá mầm. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy thu được kết quả như ở bảng 11, hình 13 và 14
Bảng 11. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp
Phương thức
biến nạp Số mẫu chết Số mẫu sống
Số mẫu chuyển gen thành công Tổng số mẫu Tần số chuyển gen (%) Sử dụng kim 47 (23,5%) 153 (76,5%) 41 200 20,5 Không sử dụng kim 29 (14,5%) 171 (85,5%) 25 200 12,5 (A) (B)
Hình 13. Đậu tương ĐT26 sau thí nghiệm sử dụng kim gây tổn thương nốt lá mầm
Hình 14. Ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá mầm và trụ dưới lá mầm của hạt đến tỷ lệ sống và tần số chuyển gen
Quan sát hình 13, 14 và bảng số liệu 11, chúng tôi thấy rằng:
Tần số chuyển gen khi sử dụng kim là rất cao (20,5%) gần gấp đôi với khi không sử dụng kim (12,5%), tuy rằng tỷ lệ sống của mẫu khi sử dụng kim thấp hơn nhưng thấp hơn không đáng kể.
Từ đó thấy rằng việc sử dụng kim làm tổn thương nốt lá mầm của hạt trước khi biến nạp mang lại hiệu quả chuyển gen rất cao.
Hiện nay với phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm trước khi thực hiện quá trình lây nhiễm đã thu được những kết quả nhất định trong nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương. Paz et al. đã sử dụng phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm và chọn lọc bằng glufosinat với giống Willams 79 và Williams 82 thu được tần số chuyển gen là 2 – 6,3% [26]. Zeng et al. cũng đã xây dựng quy trình chuyển gen thông qua A.tumefaciens vào giống Williams 82 bằng phương pháp nốt lá mầm cho tần số chuyển gen là 0,1-5,9% [38]. Xue R.G. et al. sử dụng hệ thống kim gây tổn thương nốt lá mầm của nửa hạt, sau đó cho lây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens
chủng LBA4404 mang vector pGB chứa gen bar (gen kháng phosphinothricin) và gen sgfp ( protein huỳnh quang xanh) đã thu được hiệu quả chuyển gen là 8,9-15,1% [31]. Liu et al. sử dụng A.tumefaciens làm trung gian và sử dụng phương pháp nốt lá
mầm, chọn lọc bằng hygromycin với 5 giống đậu tương Trung Quốc thu được hiệu quả biến nạp là 3,8-11,7%[25].
Ở Việt Nam, đã có nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa với các giống Williams, Maverick, MTĐ 176, Kl202 cũng sử dụng phương pháp gây tổn thương nốt lá mầm của nửa hạt và chọn lọc bằng glufosinat thu được tần số chuyển gen là 1-5% [7].
Như vậy, tần số chuyển gen vào đậu tương thông qua A.tumefaciens và sử dụng phương pháp nốt lá mầm đem lại hiệu quả cao, ngày càng có những cải tiến để hiệu quả chuyển gen cao hơn.