c. Một số đặc tính của tế bào ung thƣ phù hợp với mô hình nuôi cấy 3D
2.2.1.Phƣơng pháp SR B xác định độc tính đối với TBUT của các hoạt
trong mô hình in vitro
a, Nạp tế bào
8000 tế bào trong 180 µl môi trường nuôi cấy DMEM (hoặc RPMI) tùy thuộc từng dòng tế bào với hàm lượng 10% FBS, được nạp vào các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng, sau đó được ủ trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 370C, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24h trước khi tiến hành ủ với hoạt chất.
b, Ủ với thuốc thử
Sau 24h nuôi cấy, đĩa thí nghiệm được cho thêm vào mỗi giếng 20µl dịch thuốc đã pha trong môi trường nuôi cấy có nồng độ đặc gấp 10 lần liều thử. Tế bào được ủ với các chất theo 5 nồng độ 30μM -10μM -3μM -1μM – 0,3μM trong 48h. Mỗinồng độ được lặp lại 4 lần. Sau đó đem cố định với TCA.
c, Nhuộm với SRB
10 phút bằng dung dịch SRB 4% với lượng 100µl/giếng ở nhiệt độ phòng. Lượng SRB dư thừa được rửa trôi bằng dung dịch 1% axit axetic, lặp lại 5 lần. Sau đó hong khô ở nhiệt độ phòng.
d, Hòa tan thuốc nhuộm
Thuốc nhuộm đã bám vào protein được thôi ra bằng cách lắc nhẹ trên máy lắc với 100 µl dung dịch 10mM tris-base/giếng.
e, Đo mật độ quang học
Mật độ quang học của dung dịch SRB vừa được thôi ra trong các giếng được xác định bằng máy Microplate reader Model 680 (BioRad) ở bước sóng 540 nm.
f, Tính toán số liệu và ghi kết quả
Dựa vào giá trị mật độ quang học đo được, xác định % tỷ số tăng sinh A của tế bào theo công thức sau:
A (%) = T
VH x 100%
Trong đó:
VH: là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi dùng để pha hoạt chất .
T : là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với hoạt chất
Nếu : A = 50% thì có nghĩa là thuốc đã ức chế và làm chết 50% tế bào. Nồng độ của hoạt chất khi A đạt giá trị 50% gọi là liều gây ức chế 50% sự phát triển của tế bào, kí hiệu là IC50.