c. Một số đặc tính của tế bào ung thƣ phù hợp với mô hình nuôi cấy 3D
2.1.2.1. Hóa chất thí nghiệm
Bảng 1. Hóa chất sử dụng trong đề tài
Tên hóa chất Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất
Axit acetic Merck Đức
Agarose Sigma Hoa Kỳ
DMSO Prolabo Hoa Kỳ
Dung dịch sinh lý (NaCl 0,9%) Viê ̣t Nam
Ethanol Guangdong Guanghua
Chemical Factory Trung Quốc
FBS Invitrogen Hoa Kỳ
Methanol Guangdong Guanghua
Chemical Factory Trung Quốc
PBS Invitrogen Hoa Kỳ
Peniciline/Streptomicin Invitrogen Hoa Kỳ
RPMI 1640 Invitrogen Hoa Kỳ
SRB (Sulforhodamine B) Merck Đức
TCA Merck Đức
Tris Base MPBio – USA Hoa Kỳ
Trypsin Invitrogen Hoa Kỳ
2.1.2.2. Dụng cụ và vật tư tiêu hao
Bảng 2. Dụng cụ và vật tƣ tiêu hao
Tên dụng cụ Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất
Bơm kim tiêm 1ml, 5ml Mediplast Viê ̣t Nam
Bông, giấy thấm Viê ̣t Nam
Buồng đếm tế bào Malassez Pháp
Đầu tip 10, 200, 1000µl Corning Hoa Kỳ
Đĩa nuôi cấy tế bào Corning Hoa Kỳ
Đĩa nuôi cấy 96 giếng Corning Hoa Kỳ
Ống ly tâm 1,5ml Corning Hoa Kỳ
Lam kính, lamen Sail Brand Trung Quốc
2.1.2.3. Thiết bị nghiên cứu
Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng cho đề tài được liệt kê ở Bảng 3:
Bảng 3. Các thiết bị sử dụng
Tên thiết bị Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất
Kính hiển vi quang học Carl Zeiss Đức
Kính hiển vi soi ngược Axiovert
40 CFL Carl Zeiss Đức
Máy ly tâm Universal 320 Hettich Đức
Pipett aid Gilson Pháp
Tủ ấm 5% CO2 Shel Lab Hoa Kỳ
Tủ hood Esco Đức
Microplate Reader Model 680 Bio – Rad Nhật Bản
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp SRB - xác định độc tính đối với TBUT của các hoạt chất trong mô hình in vitro trong mô hình in vitro
a, Nạp tế bào
8000 tế bào trong 180 µl môi trường nuôi cấy DMEM (hoặc RPMI) tùy thuộc từng dòng tế bào với hàm lượng 10% FBS, được nạp vào các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng, sau đó được ủ trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 370C, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24h trước khi tiến hành ủ với hoạt chất.
b, Ủ với thuốc thử
Sau 24h nuôi cấy, đĩa thí nghiệm được cho thêm vào mỗi giếng 20µl dịch thuốc đã pha trong môi trường nuôi cấy có nồng độ đặc gấp 10 lần liều thử. Tế bào được ủ với các chất theo 5 nồng độ 30μM -10μM -3μM -1μM – 0,3μM trong 48h. Mỗinồng độ được lặp lại 4 lần. Sau đó đem cố định với TCA.
c, Nhuộm với SRB
10 phút bằng dung dịch SRB 4% với lượng 100µl/giếng ở nhiệt độ phòng. Lượng SRB dư thừa được rửa trôi bằng dung dịch 1% axit axetic, lặp lại 5 lần. Sau đó hong khô ở nhiệt độ phòng.
d, Hòa tan thuốc nhuộm
Thuốc nhuộm đã bám vào protein được thôi ra bằng cách lắc nhẹ trên máy lắc với 100 µl dung dịch 10mM tris-base/giếng.
e, Đo mật độ quang học
Mật độ quang học của dung dịch SRB vừa được thôi ra trong các giếng được xác định bằng máy Microplate reader Model 680 (BioRad) ở bước sóng 540 nm.
f, Tính toán số liệu và ghi kết quả
Dựa vào giá trị mật độ quang học đo được, xác định % tỷ số tăng sinh A của tế bào theo công thức sau:
A (%) = T
VH x 100%
Trong đó:
VH: là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi dùng để pha hoạt chất .
T : là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với hoạt chất
Nếu : A = 50% thì có nghĩa là thuốc đã ức chế và làm chết 50% tế
bào. Nồng độ của hoạt chất khi A đạt giá trị 50% gọi là liều gây ức chế 50%
sự phát triển của tế bào, kí hiệu là IC50.
2.2.2. Phƣơng pháp thử tác dụng của hoạt chất trên spheroid MCF7
2.2.2.1. Phương pháp tạo spheroid MCF7
Đun nóng agarose bằng lò vi sóng ở nhiệt độ 1200C trong 15 phút Làm nóng môi trường nuôi cấy bằng tủ sấy ở 700C trong 5 phút
Pha agarose 3% trên với môi trường đã đun nóng (tỷ lệ 1:1) được agarose 1,5%.
Nhỏ 50µl agarose trên vào mỗi giếng
Sau 2h để agarose đông hoàn toàn, nhỏ tiếp 150µl môi trường/giếng.
Bƣớc 2: Chuẩn bị tế bào
Hoạt hóa tế bào từ Nitơ lỏng:
Rã đông tế bào lưu giữ trong Nitơ lỏng (-1960C). Phân tán tế bào trong môi trường nuôi cấy thích hợp (khoảng 7ml MT) trong ống falcon 15ml. Đem ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút
Thu tế bào lắng, phân tán tế bào trong môi trường nuôi cấy thích hợp có bổ sung 20% FBS, ủ trong tủ ấm 370
C, 5% CO2 . Nuôi tế bào đến khi tế bào bám mặt đĩa nuôi cấy khoảng 75-90% thì tiến hành thu tế bào.
Thu tế bào: sử dụng trypsin để tách tế bào khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. Xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Thoma.
Bƣớc 3: Tạo spheroid
Nhỏ 20µl tế bào (nồng độ 5000TB/20µl) lên nắp đĩa Đậy nắp đĩa vào đĩa agarose đã chuẩn bị trước Nuôi trong tủ ấm 370C, 5% CO2.
Sau 2 ngày tiến hành hạ giọt treo xuống nền agarose.
2.2.2.2. Thiết kế thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất meso-dihydroguairetic acid trên spheroid MCF7 acid trên spheroid MCF7
Sau khi hạ giọt spheroid, để spheroid phát triển ổn định, sau khoảng 5-7 ngày tiến hành tra mẫu hoạt chất với 5 nồng độ khác nhau: 30, 20, 15, 10, 5 µM. Đồng
thời tiến hành tra taxol ở các giếng đối chứng thử với taxol với 5 nồng độ là: 30; 3; 0,3; 0,03; 0,003 µg/ml (Bảng 4).
Bảng 4. Bố trí thí nghiệm thử tác dụng của hoạt chất 1 trên mô hình spheroid MCF7 3.8(µM) Taxol (µg/ml) A M VH 30 20 15 10 5 30 3 0,3 0,03 0,003 B M VH 30 20 15 10 5 30 3 0,3 0,03 0,003 C M VH 30 20 15 10 5 30 3 0,3 0,03 0,003 D M VH 30 20 15 10 5 30 3 0,3 0,03 0,003 E MT VH F MT VH G MT VH H MT VH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
(M): Giếng được nạp môi trường nuôi cấy; (MT): Giếng gồm môi trường nuôi cấy và spheroid; (VH): Giếng gồm môi trường nuôi cấy, spheroid và dung môi pha mẫu dùng
làm đối chứng.
Quy ước: Ngày tiến hành tra thuốc được tính là ngày 0. Các ngày tiếp theo sau khi tra thuốc được tính là ngày 1, 2, 3,..
2.2.2.3. Xác định thể tích khối spheroid MCF7
Tiến hành theo dõi sự phát triển của khối spheroid dưới tác dụng của thuốc ở các nồng độ khác nhau. Chụp ảnh spheroid MCF7 sau đó dùng phần mềm Carl Zeiss Axio Vision 4.5 để đo đường kính khối cầu spheroid. Sau đó tính thể tích spheroid theo công thức của Rolf Bjerkvig [29].
- Đối với những spheroid bình thường có hình dạng khối cầu thì tính thể tích khối cầu spheroid theo công thức:
V= 4
3.π.(a.b)
3/2
- Đối với những spheroid bất thường không còn hình dạng khối cầu thì tính thể tích khối spheroid theo công thức: V= 0,4.a.b2
b: đường kính lớn nhất của khối cầu
V: thể tích khối cầu spheroid.
2.2.3. Phƣơng pháp gây u rắn và thử tác dụng chống ung thƣ của hoạt chất 1 trên chuột trên chuột
2.2.3.1. Gây u
Chuột 05 tuần tuổi (trọng lượng trung bình 18 - 20g) sau khi được bắt về 01 ngày, được tiến hành gây u.
Dùng sơranh, kim 18G tiêm 0,2ml huyền dịch tế bào Sarcoma180 (tương đương 106 tế bào) vào dưới da vùng ngực (lệch về phía bên phải chuột) để tạo u rắn trên chuột.
2.2.3.2. Phân lô
Sau 05 ngày cấy truyền, quan sát thấy khối u rắn đã xác định rõ, tiến hành phân lô, đo kích thước khối u và trọng lượng.
Chuột được chia làm 07 lô:
01 Lô Đối chứng sinh học - viết tắt là ĐCSH: chuột khỏe mạnh bình thường, không cấy truyền TBUT.
01 Lô Đối chứng ung thư - viết tắt là ĐCUT: chuột được cấy truyền TBUT.
01 Lô Đối chứng ung thư uống dung môi - viết tắt là ĐCDM: chuột được cấy truyền TBUT, uống dung môi là dầu gấc.
01 Lô Đối chứng ung thư uống 6-MP – viết tắt UT+6-MP: chuột được
cấy truyền TBUT, uống 6-MP pha trong nước cất.
03 lô đối chứng ung thư uống hoạt chất 1 - viết tắt là UT+1 (1g/kg); UT+1 (0,5g/kg); UT+1 (0,2g/kg): chuột được cấy truyền TBUT, uống hoạt chất 1 pha trong dung môi dầu gấc với nồng độ hoạt chất lần lượt là 1g; 0,5g; 0,2g hoạt chất trên 1kg thể trọng chuột.
2.2.3.3. Cách cho uống
Dùng sơranh (có kim cho uống dài, đầu tù) cho sâu vào trong cổ họng chuột để tránh hiện tượng chuột nhè thuốc ra ngoài, cho chuột uống vào các ngày thứ 2, 3, 5, 6 trong tuần.
2.2.3.4. Liều uống
Chất 1: 3 liều uống tương ứng với 3 lô là 1g; 0.5g; 0.2g/kg thể trọng tương đương với 20; 10; 4mg/con/lần.
6-MP: liều uống 0,96 mg/con/lần. ĐCDM: uống dầu gấc 100µl /con/lần.
Bảng 5. Phân bố thời gian và liều lƣợng cho chuột uống ở các lô thí nghiệm
LÔ SỐ
LƢỢNG NGÀY UỐNG LIỀU UỐNG
T.GIAN UỐNG
ĐCSH 10
ĐCUT 10
ĐCDM 10 5,7,9,12,13,15,16,19,20,22,24 100µl/con/lần 24 ngày
UT+6MP 10 5,7,9,12,13,15,16,19,20,22,24 0.96mg/con/lần 24 ngày
UT+1 (1g/kg) 10 5,7,9,12,13,15,16,19,20,22,24 20mg /con/lần 24 ngày
UT+1 (0.5g/kg) 10 5,7,9,12,13,15,16,19,20,22,24 10mg /con/lần 24 ngày
UT+1 (0.2g/kg) 10 5,7,9,12,13,15,16,19,20,22,24 4mg/con/lần 24 ngày
2.2.3.5. Xác định kích thước khối u
Đo kích thước để theo dõi sự thay đổi kích thước khối u rắn ( từ ngày thứ 5 sau khi cấy truyền): đo đường kính nhỏ nhất (a), đường kính lớn nhất (b) và chiều cao (c) của khối u bằng thước kẹp, sau đó tính thể tích khối u rắn theo công thức:
2.2.3.6. Xử lý số liệu
Tất cả các số liệu được xử lý bằng chương trình Microsoft Excel 2007. Các giá trị trung bình, tổng được tính toán bằng các hàm toán học. Các số liệu biểu diễn dưới dạng ± SD được xử lý bằng các hàm thống kê trong công cụ Data Analysis [2].
Các ứng dụng:
- Các hàm tính toán: SUM, AVERAGE, STDEV…
- So sánh trung bình giữa hai nhóm với nhau ở cùng thời điểm bằng thuật toán Student’s t test với trường hợp mẫu nhỏ, chưa xác định được phương sai và so sánh hai chiều.
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ
3.1. KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TRÊN CÁC DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ
VÀ DÒNG TẾ BÀO THƢỜNG
Phần lớn các chất thử đều có tác dụng ức chế tăng trưởng của các dòng tế bào tại nồng độ cao nhất là 30μM. Tại nồng độ này, sau 48 giờ ủ với mẫu, các tế bào chết nhiều và mật độ tế bào thưa thớt (hình 6).
HepG2
(a) (b)
H460
Hình 6. Tế bào sau trƣớc và sau 48h ủ với meso-dihydroguairetic acid nồng độ 30μM
Sau khi ủ với hoạt chất, các tế bào co tròn, không còn khả năng bám dính trên bề mặt nuôi cấy. Mật độ tế bào thưa thớt (a): trước khi ủ với chất 1; (b): sau khi ủ với chất 1
Số liệu đo OD cho thấy tại nồng độ thử là 30μM, ở một số giếng, số lượng tế bào giảm mạnh so với đối chứng và thậm chí thấp hơn giá trị đo OD của đĩa Tz là đĩa đối chứng số lượng tế bào tại thời điểm bắt đầu ủ với thuốc. Điều đó chứng tỏ
tại nồng độ này, các hoạt chất không chỉ ức chế tăng sinh mà còn có thể gây chết tế bào dẫn đến sự suy giảm số lượng tế bào như trên. Tuy nhiên ở các nồng độ thấp hơn, các chất lại có ảnh hưởng khác nhau.
Hoạt chất có hoạt tính mạnh nhất là meso-dihydroguairetic acid. Khi thử tác dụng trên 08 dòng tế bào ung thư thì chất này đều có biểu hiện ức chế tăng sinh tế bào với giá trị IC50 trong khoảng 10μM đến 33,4μM (Bảng 6). Trong một nghiên cứu trước đây của Park S. [26], cũng cho thấy meso-dihydroguairetic acid ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác. Chúng tôi cũng nhận thấy hoạt chất đã gây ức chế sự tăng trưởng của hầu hết các dòng tế bào ung thư theo quy luật nồng độ - tức là khi nồng độ tăng thì ảnh hưởng của hoạt chất cũng tăng, và ở nồng độ cao nhất thì khả năng ức chế của hoạt chất là lớn nhất [13]. Đối với dòng H358, tại nồng độ thử 30 µM, meso-dihydroguairetic acid ức chế đến 91,18% sự phát triển của tế bào còn ở nồng độ thấp nhất thì không có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tế bào. meso-
dihydroguairetic acid có ảnh hưởng lớn nhất trên dòng H358 với giá trị IC50 nhỏ nhất là 10,11 µM. Dòng tế bào ít chịu ảnh hưởng của meso-dihydroguairetic acid nhất là dòng HeLa với IC50 là 33.4 µM.
Theo những công bố trước đây, hoạt chất macelignan có khả năng kháng khuẩn [14]..Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu hoạt tính của hoạt chất đối với sự tăng trưởng của tế bào ung thư. Kết quả cho thấy macelignan không có phổ tác dụng rộng như meso-dihydroguairetic acid mà lại có tác dụng chọn lọc trên 2 dòng tế bào ung thư. Điều thú vị là hoạt chất này cũng có khả năng ức chế là dòng tế bào ung thư phổi H358 với giá trị IC50 tương đương với hoạt chất meso-
dihydroguairetic acidvà ức chế dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela với giá trị IC50
là 25,07 µM. Mặc dù không có tác dụng rõ rệt đối với 06 dòng tế bào còn lại nhưng sự ức chế một cách chọn lọc cũng là một trong những đặc tính quan trọng trong việc phát triển các thuốc điều trị ung thư. Đối với việc sàng lọc chất, những hoạt chất càng thể hiện khả năng tác động một cách chọn lọc thì hiệu quả trong ứng dụng điều trị trên lâm sàng càng cao.
Hai hoạt chất còn lại là fragransin A2, nectandrin B thì hầu như không có tác dụng gì đến sự phát triển của các dòng tế bào ung thư, với giá trị IC50 tính được là rất cao. Trong một số trường hợp không thể tính được giá trị này do chỉ số OD luôn tương đương với đối chứng ở tất cả các nồng độ (thể hiện ở dạng đồ thị là đường nằm ngang). Đây chính là một dạng đồ thị thể hiện các hoạt chất không có hoạt tính sinh học.
Bảng 6. Giá trị IC50 của các hoạt chất trên các dòng tế bào ung thƣ
Mẫu thử Giá trị IC50 (M)a H1299 H358 H460 Hela HepG2 KPL4 MCF7 RD 1 27,7±1,0 10,1±4,0 27,7±1,1 > 30 15,1±3,5 22,1±1,4 16,9±1,1 16,7±4,1 2 > 30 10,0±1,0 > 30 25,1±3,8 > 30 > 30 > 30 > 30 3 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 4 > 30 > 30 > 30 > 30 27,7±0.9 > 30 > 30 > 30 Taxolb 6,4±0.1 4,9±0,2 4,7±0.4 4,9±0,6 6,1±0.1 6,0±0,2 6,6±0,8 5,7±0,4 a
Kết quả là trung bình cộng các giá trị IC50 của bốn lần làm thí nghiệm (±SD); bChất đối chứng dương (paclitaxel 97%).
Chúng tôi cũng tiến hành thử độc tính của các hoạt chất trên dòng tế bào thường là dòng tế bào MDCK – dòng tế bào thận chó. Giá trị mật độ quang học OD thu được cho thấy các hoạt chất đều không gây độc cho tế bào MCDK ở tất cả các nồng độ thử. Tỷ số tăng trưởng của tế bào đạt xấp xỉ 100% so với đối chứng. Ngay cả với hoạt chất có hoạt tính sinh học cao nhất là meso-dihydroguairetic acid thì tỷ số tăng trưởng vẫn đạt 87,76% so với đối chứng khi thử ở nồng độ cao nhất (30 µM). Điều này khẳng định các hoạt chất được tách chiết từ hạt nhục đậu khấu không gây độc cho dòng tế bào thường MDCK.
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 0 5 10 15 20 25 30 35 A% nồng độ (µM)
Ảnh hưởng chất 1 lên 8 dòng tế bào
dòng H358 dòng Hela dòng KPL4 dòng RD dòng HepG2 dòng H1299 dòng H460 dong MCF7 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 0 5 10 15 20 25 30 35 A% Nồng độ (µM)
Ảnh hưởng của chất 2 lên8 dòng tế bào
dòng H358 dòng Hela dòng KPL4 dòng RD dòng HepG2 dòng H1299 dòng H460 dòng MCF7 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 0 5 10 15 20 25 30 35 A% Nồng độ (µM)
Ảnh hưởng của chất 3 lên 8 dòng tế bào
dòng H358 dòng Hela dòng KPL4 dòng RD dòng HepG2 dòng H1299 dòng H460
