Sự tạo spheroid MCF7 trong thí nghiệm thử tác dụng của hoạt

Một phần của tài liệu Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hoạt nhục đầu khấu ( Myristica Fragrans (Trang 46)

c. Một số đặc tính của tế bào ung thƣ phù hợp với mô hình nuôi cấy 3D

3.2.1. Sự tạo spheroid MCF7 trong thí nghiệm thử tác dụng của hoạt

meso-dihydroguairetic acid

Các dòng tế bào khác nhau thì khả năng tạo thành spheroid và tốc độ tăng trưởng spheroid là khác nhau. Chúng tôi sử dụng dòng tế bào ung thư vú MCF7 để tạo khối cầu spheroid do những nghiên cứu trước đó về động học tăng trưởng của khối spheroid MCF7 đã chỉ ra rằng:

 Dòng MCF7 có khả năng tạo spheroid cao. Khối cầu spheroid tròn, đẹp.  Nồng độ tế bào/giọt treo có khả năng tạo spheroid tốt nhất là 4000-5000 tế

bào

 Sau 24h sau khi tạo giọt treo có thể tạo thành khối cầu spheroid.

Từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 19 sau khi tạo spheroid thì khối cầu tăng trưởng mạnh về kích thước, đến ngày thứ 22 đạt kích thước cực đại sau đó sẽ có hiện tượng thoái lui sinh khối biểu hiện ở sự tăng giảm kích thước không ổn định.

Trong thí nghiệm này, sau khi tiến hành hạ giọt treo, chúng tôi tiến hành quan sát hình dạng và sự phát triển của các khối spheroid MCF7.

Ngày bắt đầu tra hoạt chất được chúng tôi quy ước là ngày 0, các ngày tiếp theo được tính là ngày 1, 2, 3… Ở mẫu đối chứng không sử dụng hoạt chất, các khối spheroid tại các giếng đều phát triển bình thường, kích thước tương đối đồng đều. Những ngày tiếp theo, khối cầu đa bào vẫn tiếp tục phát triển, lớn lên về kích thước. Các tế bào trong khối liên kết với nhau chặt chẽ, thể hiện ở đường viền bao ngoài khối rõ nét (hình 9). Các đặc điểm trên của các khối cầu đa bào thể hiện sự tăng trưởng bình thường, phù hợp với các nghiên cứu trước đó về động học tăng trưởng của khối spheroid dòng MCF7. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành các thí nghiệm thử hoạt chất.

Ngày 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

Hình 9. Hình thái của khối spheroid MCF7 trong điều kiện nuôi cấy bình thƣờng (Độ phóng đại 10x5,6)

Khối spheroid phát triển bình thường, kích thước lớn dần theo các ngày thí nghiệm

3.2.2. Hình thái của khối spheroid MCF7 dƣới tác dụng của hoạt chất meso- dihydroguairetic acid

Ở các giếng thí nghiệm, tại nồng độ cao nhất 30µM, chỉ một ngày sau khi bổ sung hoạt chất meso-dihydroguairetic acid (hoạt chất 1), phần lớn các khối cầu spheroid MCF7 đã xuất hiện hiện tượng tan rã. Các tế bào không liên kết với nhau thành một khối chặt chẽ như đối chứng mà tách rời nhau ra, có thể nhìn thấy từng tế bào riêng rẽ. Không còn đường viền bao ngoài khối cầu mà thấy rõ từng đám tế bào tụ tập với nhau. Đến ngày thứ hai thì khối cầu đã gần như đã phân tán hết chỉ còn lại một ít đám vụn tế bào chết trên nền nuôi cấy. Như vậy, ở nồng độ cao nhất - 30µM- hoạt chất 1 có tác dụng rõ rệt đối với sự phát triển của khối spheroid dòng tế bào MCF7, làm chết tế bào và tan rã khối spheroid (hình 10). Một số ít khối cầu không tan rã hoàn toàn nhưng không còn hình dạng khối cầu spheroid nữa (hình 11).

Hình 10. Sự tan rã của khối spheroid MCF7 dƣới tác dụng của hoạt chất meso- dihydroguairetic acid ở nồng độ 30µM

(Độ phóng đại 10x5,6)

Ngày 0: spheroid tròn, đẹp, nhìn thấy rõ vành ngoài; Ngày thứ nhất sau khi tra hoạt chất MII: spheroid đã có hiện tượng tan rã, không còn dạng khối cầu. Ở ngày thứ hai, khối cầu

đã tan rã hoàn toàn, các đám tế bào chết đậm màu nằm rời rạc. Ở ngày thứ ba sau khi ủ với MII, chỉ còn lại dấu vết của khối cầu MCF7.

Ngày 0: Spheroid tròn đẹp Ngày 1: Spheroid bắt đầu bị tan rã, nhiềumảng tế bào bị bong ra

Ngày 2: Spheroid tiếp tục bị tan rã Ngày 3: Spheroid tiếp tục bị tan rã Ngày 0: Spheroid tròn đẹp Ngày 1: Spheroid bắt đầu bị tan rã, nhiềumảng tế bào bị bong ra

Ngày 2: Spheroid tiếp tục bị tan rã Ngày 3: Spheroid tiếp tục bị tan rã

Hình 11. Sự biến đổi hình thái khối spheroid MCF7 dƣới tác dụng của hoạt chất meso-dihydroguairetic acid ở nồng độ 30µM (Độ phóng đại 10x5,6)

Hình 12. Spheroid MCF7 dƣới tác dụng của hoạt chất meso- dihydroguairetic acid ở nồng độ 20µM (Độ phóng đại 10x5,6)

Ở nồng độ 20µM: ngày đầu tiên spheroid đã có hiện tượng tan rã nhưng vẫn có thể phân biệt được vị trí các vùng khác nhau trong khối spheroid như: lõi hoại tử, vùng trung gian nhưng lớp vòng ngoài biến mất. Có thể nói vùng này chính là vùng đầu tiên biểu hiện những tác động của hoạt chất. Điều này là do vị trí của vùng bao ngoài khối spheroid nên tương tác với mẫu thử trước tiên. Mặt khác các tế bào ở vùng này là những tế bào phân chia mạnh nhất nên rất nhạy cảm và dễ bị ảnh hưởng bởi hoạt chất. Ở các ngày thứ hai và thứ ba, khối spheroid trở nên đậm màu, không còn phân biệt rõ vùng trung gian và lõi hoại tử. Các tế bào co đặc và có màu đen khi quan sát dưới kính hiển vi. Đây chính là biểu hiện của các tế bào chết (hình 12)

Đối với các nồng độ 15µM,10µM của hoạt chất 1, chúng tôi cũng thu được các hiện tượng tương tự. Tức là khối cầu spheroid sau 1 đến 2 ngày tra thuốc thì có hiện tượng tan rã, các tế bào không còn liên kết được với nhau chặt chẽ, các tế bào đen lại và chết đi. Tuy nhiên ở các nồng độ khác nhau của hoạt chất, tốc độ ảnh hưởng lên tế bào là khác nhau với xu hướng giảm dần khi nồng độ giảm. Ở nồng độ 5µM thì ảnh hưởng của hoạt chất 1 lên khối cầu là nhỏ nhất, khối cầu cũng có hiện tượng tan rã nhưng tốc độ chậm hơn, bắt đầu vào ngày thứ 3 sau khi tra mẫu.

Chúng tôi cũng tiến hành quan sát hình ảnh của khối cầu spheroid dưới tác dụng của taxol – thuốc được chúng tôi sử dụng làm đối chứng dương trong thí nghiệm này để so sánh với ảnh hưởng của hoạt chất 1.

Ngày 0

Ngày 2

Ngày 1

Ngày 3

Hình 13. Hình ảnh của MCF7 dƣới tác dụng của taxol ở nồng độ 30µM

(Độ phóng đại 10x5,6)

Ngày 0

Ngày 2

Ngày 1

Ngày 3

Hình 14. Hình ảnh của MCF7 dƣới tác dụng của taxol ở nồng độ 20µM

Taxol cũng có những ảnh hưởng đến sự phát triển của khối cấu spheroid. Ở nồng độ taxol cao nhất - 30µM, một ngày sau khi tra thuốc, khối cầu spheroid đã có hiện tượng tan rã vùng vành ngoài. Toàn bộ khối cầu đa bào đen lại, nhưng các tế bào vẫn tập trung với nhau cho đến tận ngày thứ 3 sau khi tra mẫu (hình 13). Ở các nồng độ taxol thấp hơn thì phải đến ngày thứ 3 sau khi tra mẫu, spheroid mới đen lại và không nhìn rõ vành ngoài khối cầu. Khối cầu cũng có hiện tượng tan rã nhưng không tan mạnh bằng khối cầu dưới ảnh hưởng của hoạt chất 1 (hình 14).

Điều này cho thấy taxol có hiệu lực làm chết tế bào trước khi các tế bào mất đi sự liên kết với nhau. Tác động này khác với ảnh hưởng của hoạt chất 1. Những quan sát trên khối cầu đa bào khi ủ với hoạt chất 1 cho thấy các tế bào rời nhau ra trước khi trở nên đen đặc lại. Có thể hoạt chất 1 có tác dụng lên sự liên kết giữa các tế bào trong khối cầu spheroid. Khi sự liên kết này mất đi, các tế bào không có khả năng duy trì cấu trúc khối cầu, đồng thời sự mất liên lạc giữa các tế bào với nhau và giữa tế bào với chất nền bám dính làm tế bào chết.

3.2.3. Thể tích khối spheroid MCF7 dƣới ảnh hƣởng của hoạt chất 1

Để xác định rõ ảnh hưởng của hoạt chất 1 đến sự tăng trưởng kích thước khối cầu spheroid dòng MCF7, chúng tôi tiến hành đo kích thước khối cầu spheroid ở các ngày 0, 1, 2, 3 tính từ ngày tra chất. Kết quả thu được như sau:

Bảng 7. Tỷ lệ tan rã khối cầu spheroid dƣới tác dụng của hoạt chất 1

Nồng độ Tỷ lệ spheroid bị tan/ tổng số VH 0 Nồng độ 30 µM 2/3 số lượng Nồng độ 20 µM 1/2 số lượng Nồng độ 15 µM 0 Nồng độ 10 µM 0 Nồng độ5 µM 0

Tại các nồng độ thử 30µM và 20 µM của hoạt chất 1, nhiều khối spheroid có hiện tượng tan rã hoàn toàn nên chúng tôi chỉ đo kích thước ở các vẫn còn hình dạng cầu hoặc không phải dạng cầu và tính thể tích khối spheroid theo công thức đã nêu ở phần phương pháp.

Để thấy rõ sự thay đổi về kích thước khối cầu spheroid qua các lần đo, chúng tôi tiến hành tính tỷ lệ (%) thể tích khối cầu ở các lần đo và so sánh với tỷ lệ (%) thể tích khối spheroid ở giếng đối chứng (coi kích thước spheroid ngày đầu là 100%) (bảng 8). Đây cũng là một giá trị quan trọng để đánh giá tác dụng của chất thử lên sự tăng trưởng của khối u.

Kết quả cho thấy spheroid đối chứng phát triển ổn định và tăng nhanh về kích thước, đạt kích thước tăng 256.99% ở ngày thứ 3 so với ngày đầu trước khi ủ với chất. Còn hoạt chất 1 thấy rõ tác dụng ức chế và làm giảm đáng kể thể tích khối cầu spheroid. Chỉ ở ngày thứ 2 (tức là sau khi tra thuốc 1 ngày), thể tích khối spheroid đã giảm đáng kể ở tất cả các nồng độ 10, 15, 20, 30 µM. Đến ngày thứ 4 thì thể tích khối cầu spheroid gần như không đáng kể (chỉ còn vài % so với ngày thứ nhất). Điều này cho thấy rõ tác dụng ức chế tăng trưởng khối cầu spheroid của hoạt chất 1. Hiện tượng này có thể giải thích là do cơ chế tác động của hoạt chất 1 ức chế sự tương tác giữa các tế bào, khiến cho tế bào không thể liên kết với nhau nên sự sống và sự phân chia của tế bào bị ảnh hưởng dẫn đến sự suy giảm kích thước khối spheroid một cách mạnh mẽ so với đối chứng.

Bảng 8. Tỷ lệ kích thƣớc khối spheoroid dƣới ảnh hƣởng của hoạt chất 1 qua các lần đo so với ngày đầu trƣớc khi tra hoạt chất

Lần đo ngày 0 (%) ngày 1/0 (%) Ngày 2/0 (%) ngày 3/0 (%) VH 100 201,34 212,46 256,99 30µM 100 8,47 8,00 7,45 20µM 100 7,00 6,08 6,16 15µM 100 6,28 6,66 6,76 10µM 100 9,50 9,72 10,95 5µM 100 190,69 207,36 308,37

0 50 100 150 200 250 300 350 0 1 2 3 4 5 Lần đo % VH Nồng độ 30µM Nồng độ 20µM Nồng độ 15µM Nồng độ 10µM Nồng độ 5µM

Hình 15. Đồ thị về tỷ lệ kích thƣớc khối spheroid dƣới ảnh hƣởng của chất 1 theo thời gian (VH: ĐCSH)

Từ bảng và đồ thị tăng trưởng kích thước khối spheroid qua các lần đo dưới ảnh hưởng của hoạt chất 1, có thể thấy rõ tác dụng ức chế và làm giảm đáng kể thể tích khối cầu spheroid của hoạt chất 1. Chỉ ở ngày thứ 2 sau khi tra thuốc, thể tích khối spheroid đã giảm đáng kể ở tất cả các nồng độ 10, 15, 20, 30 µM. Đến ngày thứ 3 thì thể tích khối cầu spheroid gần như không đáng kể (chỉ còn vài % so với ngày thứ nhất). Điều này cho thấy rõ tác dụng làm giảm thể tích khối cầu spheroid của hoạt chất 1. Riêng đối với spheroid dưới ảnh hưởng của hoạt chất với nồng độ nhỏ nhất 5µM thì thể tích spheroid vẫn tăng bình thường giống với spheroid đối chứng. Điều này chứng tỏ ở nồng độ nhỏ nhất 5µM thì hoạt chất hầu như không có tác dụng lên sự phát triển của khối cầu spheroid.

Chúng tôi cũng tiến hành đo kích thước của khối cầu spheroid dưới ảnh hưởng của thuốc taxol – được sử dụng làm đối chứng dương. Sau đó tính tỷ lệ (%) thể tích khối cầu ở các lần đo so với lần đo đầu tiên. Kết quả đo được chúng tôi tổng hợp lại vào bảng sau:

Bảng 9. Tỷ lệ kích thƣớc khối spheroid dƣới ảnh hƣởng của taxol qua các lần đo so với ngày đầu trƣớc khi tra thuốc

Lần đo ngày 0 (%) ngày 1/0 (%) ngày 2/0 (%) ngày 3/0 (%) VH 100,00 201,34 212,46 256,99 30µM 100,00 9,64 8,96 9,50 20µM 100,00 17,79 17,21 19,67 15µM 100,00 9,83 10,47 10,55 10µM 100,00 10,75 13,40 14,69 5µM 100,00 10,79 11,50 11,04 0 50 100 150 200 250 300 0 1 2 3 4 5 Lần đo % VH nồng độ 30µM nồng độ 20µM nồng độ 15µM nồng độ 10µM nồng độ 5µM

Hình 16. Đồ thị tỷ lệ kích thƣớc khối spheroid dƣới ảnh hƣởng của taxol theo thời gian (VH: ĐCSH)

Đối với spheroid dưới ảnh hưởng của taxol thấy kích thước spheroid giảm đi rõ rệt. Đến ngày thứ 3 thì kích thước spheroid gần như bằng 0 chứng tỏ khối cầu spheroid gần như đã tan hoàn toàn. Kết quả này là rất đáng quan tâm, chứng tỏ tác dụng của thuốc trên mô hình spheroid là không kém so với thuốc đối chứng dương taxol, một loại thuốc điều trị ung thư đã được bán trên thị trường.

Từ những kết quả trên là tiền đề để chúng tôi triển khai nghiên cứu tác dụng của thuốc trên mô hình in vivo và hy vọng khi thử tác dụng của thuốc trên mô hình

in vivo sẽ cho kết quả tương tự như khi thử tác dụng của thuốc ở mô hình in vitro và mô hình khối cầu spheroid MCF7 – mô hình được coi như một khối cầu đa bào ung thư thu nhỏ và đã cho kết quả tốt.

3.3. SỰ BIẾN ĐỔI VỀ THỂ TÍCH VÀ HÌNH THÁI KHỐI U RẮN Sar180 TRÊN CHUỘT SWISS DƢỚI TÁC DỤNG CỦA CHẤT 1 Ở CÁC LIỀU TRÊN CHUỘT SWISS DƢỚI TÁC DỤNG CỦA CHẤT 1 Ở CÁC LIỀU THỬ KHÁC NHAU

3.3.1. Ảnh hƣởng của hoạt chất đến kích thƣớc khối u

Tiến hành tạo u rắn trên chuột chúng tôi đã thu được tỷ lệ tạo u là rất cao. Tỷ lệ tạo u đạt tới 95% (66/70 con chuột cấy truyền tế bào ung thư tạo thành u).

Để theo dõi ảnh hưởng của hoạt chất đến sự tăng trưởng kích thước khối u chúng tôi tiến hành đo kích thước khối u rắn bằng thước kẹp, theo dõi sự thay đổi kích thước u rắn trên từng chuột thí nghiệm.

Mỗi lô thí nghiệm có 10 con và được đánh dấu riêng biệt để theo dõi kích thước u ở từng con. Tiến hành đo đường kính nhỏ nhất (kí hiệu a-mm), đường kính lớn nhất (kí hiệu b-mm) và chiều cao (kí hiệu c-mm) của khối u ở mỗi con chuột, sau đó tiến hành tính thể tích u trung bình ở mỗi lô.

Chúng tôi nhận thấy, ở lô đối chứng sinh học, chuột phát triển bình thường, tăng đều về kích thước và trọng lượng, nhanh nhẹn, chứng tỏ điều kiện chăm sóc là phù hợp..

Ở các lô ĐCUT và ĐCDM thể tích khối u tăng liên tục và tăng rất nhanh sau mỗi lần đo. Còn ở các lô điều trị bằng hoạt chất 1 và đối chứng 6-MP, chỉ sau 1 đến 2 tuần điều trị một số chuột đã có hiện tượng tiêu u (thể tích khối u giảm dần sau đó hết hẳn), số còn lại cũng có hiện tượng tăng kích thước khối u nhưng sự tăng kích thước khối u là rất chậm và nhỏ hơn nhiều so với các lô ĐCUT và ĐCDM. Tỷ lệ chuột tiêu hết u sau khi sử dụng hoạt chất 1 được chúng tôi liệt kê ở Bảng 10.

Từ kết quả của bảng 10 chúng tôi nhận thấy rõ tác dụng của hoạt chất 1 trên chuột mang u rắn. Có đến 50% chuột mang u rắn tiêu hết u sau khi điều trị hoạt chất

1 ở nồng độ cao nhất 1g/kg thể trọng. Cao hơn so với lô đối chứng sử dụng thuốc 6- MP (lô 6-MP đạt tỷ lệ tiêu u là 40%).

Ở hai lô điều trị với hoạt chất 1 ở nồng độ thấp hơn là 0,5g/kg thể trọng và 0,2g/kg thể trọng cũng đạt tỷ lệ tiêu u là rất cao 30%. Điều này rất có ý nghĩa vì chứng tỏ hoạt chất có hiệu quả rõ rệt trong điều trị ung thư trên chuột. Kết quả này càng khẳng định hơn nữa về tác dụng của thuốc khi thử trên hai mô hình trước đó là

in vitro và spheroid.

Bảng 10. Tỷ lệ chuột tiêu hết u ở các lô thí nghiệm

Tỷ lệ chuột tiêu hết u (%)

ĐCSH 0 ĐCUT 0 ĐCDM 0 UT + 6MP 40% UT+hoạt chất 1 (1g/kg) 50% UT+hoạt chất 1 (0.5g/kg) 30% UT+hoạt chất 1 (0.2g/kg) 30%

Đối với những chuột còn lại mà không có hiện tượng tiêu hết u được tiến hành tính thể tích u trung bình để thấy rõ mức độ thay đổi kích thước khối u trên chuột qua các lần đo. Kết quả được chúng tôi thống kê vào bảng 11. Từ bảng kích thước u chuột qua các lần đo chúng tôi nhận thấy khối u chuột ban đầu có kích

Một phần của tài liệu Nghiên cứu tác dụng chống ung thư của một số hoạt chất phân lập từ hoạt nhục đầu khấu ( Myristica Fragrans (Trang 46)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(69 trang)