c. Một số đặc tính của tế bào ung thƣ phù hợp với mô hình nuôi cấy 3D
3.3.SỰ BIẾN ĐỔI VỀ THỂ TÍCH VÀ HÌNH THÁI KHỐ IU RẮN
THỬ KHÁC NHAU
3.3.1. Ảnh hƣởng của hoạt chất đến kích thƣớc khối u
Tiến hành tạo u rắn trên chuột chúng tôi đã thu được tỷ lệ tạo u là rất cao. Tỷ lệ tạo u đạt tới 95% (66/70 con chuột cấy truyền tế bào ung thư tạo thành u).
Để theo dõi ảnh hưởng của hoạt chất đến sự tăng trưởng kích thước khối u chúng tôi tiến hành đo kích thước khối u rắn bằng thước kẹp, theo dõi sự thay đổi kích thước u rắn trên từng chuột thí nghiệm.
Mỗi lô thí nghiệm có 10 con và được đánh dấu riêng biệt để theo dõi kích thước u ở từng con. Tiến hành đo đường kính nhỏ nhất (kí hiệu a-mm), đường kính lớn nhất (kí hiệu b-mm) và chiều cao (kí hiệu c-mm) của khối u ở mỗi con chuột, sau đó tiến hành tính thể tích u trung bình ở mỗi lô.
Chúng tôi nhận thấy, ở lô đối chứng sinh học, chuột phát triển bình thường, tăng đều về kích thước và trọng lượng, nhanh nhẹn, chứng tỏ điều kiện chăm sóc là phù hợp..
Ở các lô ĐCUT và ĐCDM thể tích khối u tăng liên tục và tăng rất nhanh sau mỗi lần đo. Còn ở các lô điều trị bằng hoạt chất 1 và đối chứng 6-MP, chỉ sau 1 đến 2 tuần điều trị một số chuột đã có hiện tượng tiêu u (thể tích khối u giảm dần sau đó hết hẳn), số còn lại cũng có hiện tượng tăng kích thước khối u nhưng sự tăng kích thước khối u là rất chậm và nhỏ hơn nhiều so với các lô ĐCUT và ĐCDM. Tỷ lệ chuột tiêu hết u sau khi sử dụng hoạt chất 1 được chúng tôi liệt kê ở Bảng 10.
Từ kết quả của bảng 10 chúng tôi nhận thấy rõ tác dụng của hoạt chất 1 trên chuột mang u rắn. Có đến 50% chuột mang u rắn tiêu hết u sau khi điều trị hoạt chất
1 ở nồng độ cao nhất 1g/kg thể trọng. Cao hơn so với lô đối chứng sử dụng thuốc 6- MP (lô 6-MP đạt tỷ lệ tiêu u là 40%).
Ở hai lô điều trị với hoạt chất 1 ở nồng độ thấp hơn là 0,5g/kg thể trọng và 0,2g/kg thể trọng cũng đạt tỷ lệ tiêu u là rất cao 30%. Điều này rất có ý nghĩa vì chứng tỏ hoạt chất có hiệu quả rõ rệt trong điều trị ung thư trên chuột. Kết quả này càng khẳng định hơn nữa về tác dụng của thuốc khi thử trên hai mô hình trước đó là
in vitro và spheroid.
Bảng 10. Tỷ lệ chuột tiêu hết u ở các lô thí nghiệm
LÔ Tỷ lệ chuột tiêu hết u (%)
ĐCSH 0 ĐCUT 0 ĐCDM 0 UT + 6MP 40% UT+hoạt chất 1 (1g/kg) 50% UT+hoạt chất 1 (0.5g/kg) 30% UT+hoạt chất 1 (0.2g/kg) 30%
Đối với những chuột còn lại mà không có hiện tượng tiêu hết u được tiến hành tính thể tích u trung bình để thấy rõ mức độ thay đổi kích thước khối u trên chuột qua các lần đo. Kết quả được chúng tôi thống kê vào bảng 11. Từ bảng kích thước u chuột qua các lần đo chúng tôi nhận thấy khối u chuột ban đầu có kích thước tương đối đồng đều (đường kính lớn nhất và nhỏ nhất đạt khoảng 6-7mm, chiều cao đạt khoảng 2,4-2,8mm). Sau các lần đo khác nhau thì kích thước u chuột tăng giảm khác nhau tùy thuộc vào lô thí nghiệm. Chuột ở các lô uống hoạt chất 1
có tốc độ tăng kích thước u chậm hơn rất nhiều so với chuột ở các lô đối chứng, thậm chí nhỏ hơn nhiều so với tốc độ tăng kích thước u ở lô sử dụng thuốc 6-MP, một loại thuốc chống ung thư được bán rộng rãi trên thị trường.
Bảng 11. Kích thƣớc u (mm) qua các lần đo Lần đo Kích thƣớc ĐCUT ĐCDM UT+6MP UT+1 (1g/kg) UT+1 (0,5g/kg) UT+1 (0,2g/kg) Lần đo 1 a 6,7±0,4 6,6±0,8 6,0±0,4 6,7±0,3 6,8±0,5 6,6±0,5 b 7,2±0,6 7,0±0,7 6,4±0,6 6,8±0,5 7,0±0,5 6,8±0,5 c 2,4±0,5 2,4±0,6 2,5±0,3 2,5±0,6 2,8±0,4 2,7±0,3 Lần đo 2 a 8,2±0,7 8,4±0,6 7,8±1,3 9,2±1,2 8,4±0,5 8,6±0,8 b 9,3±1,1 9,6±1,4 8,4±1,4 9,4±1,4 8,8±0,5 9,3±0,4 c 3,0±0,3 3,0±0,4 3,2±0,8 3,1±0,2 3,0±0,3 3,1±0,2 Lần đo 3 a 10,2±1,2 9,3±1,2 7,8±0,8 7,5±0,9 7,7±0,5 6,9±0,5 b 11,9±2,3 10,7±1,8 8,9±1,5 8,1±1,4 8,9±1,5 7,6±0,6 c 4,3±0,9 3,8±0,4 3,4±0,5 3,1±0,4 3,2±0,3 3,0±0,4 Lần đo 4 a 12,1±2,4 10,4±1,6 8,4±1,3 8,3±1,2 7,8±0,3 7,7±0,8 b 13,7±2,4 12,3±2,6 9,0±0,9 9,6±1,5 9,4±1,6 8,4±0,6 c 5,0±1,0 4,0±0,6 3,4±0,8 3,0±0,4 3,3±0,4 2,9±0,2 Lần đo 5 a 13,4±2,2 13,4±3,1 9,0±2,3 8,2±1,1 8,1±1,0 6,9±1,0 b 16,2±3,9 15,9±4,9 9,4±2,3 8,6±0,9 9,8±2,3 7,6±1,2 c 5,4±1,2 5,4±1,5 3,8±1,2 2,9±0,7 3,3±0,7 2,8±0,7 Lần đo 6 a 14,9±3,6 16,3±4,9 10,0±3,4 7,8±1,9 10,3±3,3 7,1±1,6 b 17,6±4,5 18,0±6,0 10,3±3,9 8,2±2,3 10,5±3,0 7,6±1,3 c 6,3±1,3 7,4±3,3 5,0±1,1 3,3±0,8 4,0±1,1 3,6±1,1 Lần đo 7 a 16,3±4,1 16,6±5,4 11,3±4,2 7,5±2,1 10,2±2,6 6,9±1,9 b 19,7±6,5 19,1±7,4 11,8±4,1 8,3±2,6 10,5±3,0 7,4±2,2 c 6,6±1,7 8,2±3,5 5,0±1,1 2,8±1,3 4,0±0,9 3,3±1,3 Lần đo 8 a 17,9±5,1 16,9±5,8 11,4±3,9 8,4±3,5 11,0±3,4 7,5±2,2 b 21,9±7,2 19,9±8,5 12,3±4,1 8,9±3,4 11,2±3,5 8,0±2,6 c 7,7±2,5 8,3±3,9 5,1±1,2 2,9±1,5 4,0±1,0 3,2±1,6
Để thấy rõ hơn ảnh hưởng của hoạt chất 1 trong việc làm giảm kích thước khối u chuột, chúng tôi tiến hành tính thể tích khối u chuột ở các lô khác nhau qua các lần đo từ đó vẽ đồ thị thể tích u qua các lần đo.
Bảng 12. Thể tích u (mm3) qua các lần đo V(mm3) ĐCUT (1) ĐCDM (2) UT+6MP (3) Chất 1 (1g/kg) (4) Chất 1 (0,5g/kg) (5) Chất 1 (0,2g/kg) (6) Lần đo 1 120,4±0,1 113,9±0,3 100,8±0,1 119,3±0,1 141,8±0,1 126,7±0,1 Lần đo 2 239,4±0,2 253,2±0,3 224,3±1,5 280,7±0,4 233,5±0,1 258,6±0,1 Lần đo 3 551,4±2,7 393,8±0,9 247,2±0,6 197,2±0,6 226,7±0,2 164,8±0,1 Lần đo 4 866,0±6,1 539,5±2,5 271,0±0,8 250,3±0,7 257,4±0,2 192,9±0,1 Lần đo 5 1238,1±10,8 1205,3±24,3 332,7±6,5 214,1±0,7 280,3±1,6 151,4±0,9 Lần đo 6 1733,2±22,4 2291,5±102,6 541,0±15,4 221,0±3,8 454,4±10,8 206,3±2,2 Lần đo 7 2204,8±48,5 2705,3±146,3 697,1±19,0 182,5±7,0 447,1±7,5 173,6±5,4 Lần đo 8 3160,9±95,8 2950,3±200,5 744,3±20,0 227,0±18,7 514,4±11,8 201,9±9,5 P(t test) P1/3<0,06 P2/1>0,05 P3/1<0,06 P4/1<0,03 P4/3<0,07 P5/1<0,04 P5/3<0,05 P6/1<0,03 P6/3<0,05 Hình 17. Đồ thị thể tích u qua các lần đo
Từ bảng và đồ thị thể tích khối u rắn của chuột ở các lô qua các lần đo, chúng tôi nhận thấy: ở lô ĐCUT và ĐCDM kích thước khối u tăng liên tục và tăng rất nhanh qua 8 lần đo, hiện tượng này chứng tỏ khối u đang trong giai đoạn phát triển rất nhanh, kích thước u tăng lên từng ngày. Ở lô ĐCDM kích thước u cũng tăng không khác biệt so với ĐCUT chứng tỏ dung môi dầu gấc ở nồng độ thử không có ảnh hưởng đến sự phát triển của khối u trên chuột thí nghiệm. Còn ở lô sử dụng với thuốc đối chứng 6-MP kích thước u cũng tăng qua các ngày đo nhưng mức độ tăng chậm hơn và tăng ít hơn nhiều so với đối chứng. Điều này hợp lý vì thuốc 6- MP là một loại thuốc điều trị ung thư, có tác dụng kìm hãm sự phát triển và tiêu diệt các tế bào ung thư đã được bán phổ biến trên thị trường. Điều đặc biệt là nhìn vào bảng 12 và hình 17 có thể thấy rõ ở tất cả 3 lô điều trị hoạt chất kích thước khối u tăng chậm hơn và ít hơn so với đối chứng 6-MP. Sự khác nhau này là có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy từ 95-97% (bảng 12). Ở hai lô điều trị hoạt chất với nồng độ cao 1g/kg và 0.5g/kg kích thước khối u tăng ít hơn nhiều so với lô đối chứng 6-MP. Kết quả này là rất được mong đợi vì chứng tỏ hoạt chất 1 phân lập từ hạt nhục đậu khấu Myristica fragrans có tác dụng ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư Sarcoma 180 trên chuột nhắt trắng Swiss.
3.3.2. Ảnh hƣởng của hoạt chất 1 đến hình thái khối u chuột
Chúng tôi cũng tiến hành chụp ảnh để theo dõi ảnh hưởng của hoạt chất lên sự thay đổi về hình thái và kích thước khối u chuột và nhận thấy ở các lô ĐCSH và ĐCDM, kích thước u chuột tăng nhanh, khối u ban đầu tròn sau khoảng 8 ngày bắt đầu xuất hiện lõi hoại tử. Kích thước lõi hoại tử tăng dần, miệng lõi hoại tử loét ra, đen đi, ảnh hưởng đến sức sống và khả năng di chuyển của chuột (hình 18). Đến ngày thứ 24 thì kích thước lõi hoại tử quá lớn, chuột di chuyển rất nặng nề, sức khỏe yếu.
Hình 18. Chuột ở lô: ĐCSH (A), ĐCDM (B)
Sau 5 ngày cấy truyên (ngày 5): khối u chuột ban đầu tròn (đường kính khoảng 6-7mm), khối u to dần, đến ngày 8 đã bắt đầu xuất hiện lõi hoại tử, miệng lõi hoại tử to dần, đen
Đối với chuột ở lô điều trị với thuốc đối chứng 6-MP thì 40% con chuột có hiện tượng tiêu hết u ở ngày thứ 13-15 tính từ ngày bắt đầu cấy truyền tế bào ung thư. Số còn lại cũng có kích thước u tăng chậm so với đối chứng. Khối u tăng chậm về kích thước, lõi hoại tử không loét ra mà khô lại, miệng lỗ hoại tử nhỏ dần sau đó bong ra (hình 19).
Hình 19. Chuột ở lô uống thuốc 6-MP
Ngày 5: ngày đầu tiên trước khi chuột sử dụng 6-MP (5 ngày sau khi tạo u).
Ngày 8: kích thước u tăng, xuất hiện lõi hoại tử. Đến ngày 20 thì khối u teo dần, miệng lõi hoại tử cũng nhỏ lại.
Ở lô sử dụng hoạt chất 1 với liều cao nhất 1g/kg thể trọng có tỷ lệ hết u cao nhất (50% số chuột có hiện tượng tiêu u). Khối u trên chuột teo dần rồi hết hẳn (hình 20). Các chuột còn lại có kích thước u tăng chậm, lõi hoại tử không loét rộng như ở các lô đối chứng mà thường khô, miệng lỗ hoại tử nhỏ. Điều này chứng tỏ hoạt chất 1 đã có tác dụng ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư và sự hình
thành khối u. Kết quả này rất có ý nghĩa cho việc định hướng thí nghiệm tiếp theo về tác dụng chống ung thư của chất số 1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khối u teo hết Khối u ban đầu
Hình 20. Chuột ở lô uống hoạt chất 1 liều 1g/kg thể trọng
Khối u ban đầu tròn đẹp. Kích thước u giảm dần ở các ngày tiếp theo. Đến ngày 20 thì chuột có hiện tượng tiêu hết u(A), hoặc giảm hẳn kích thước u(B)
Tiến hành theo dõi thời gian sống thêm của chuột trong vòng 60 ngày và thu được kết quả như sau: Đối với chuột ở lô ĐCUT chỉ sau 35 ngày kể từ khi tạo u chuột đã chết hoàn toàn. Còn ở các lô sử dụng chế phẩm 3.8 đến ngày thứ 60 còn 30% số chuột vẫn sống. Riêng lô đối chứng 6-MP thì còn đến 50% số chuột còn sống. Điều này chứng tỏ chế phẩm sử dụng đã có tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của chuột so với đối chứng không sử dụng chế phẩm nhưng chưa cao bằng lô đối chứng sử dụng thuốc 6-MP. Tuy nhiên việc làm tăng dài thời gian sống thêm của chuột cũng là một kết quả rất có ý nghĩa trong thí nghiệm này. Từ những kết quả trên có thể rút ra kết luận:
- Hoạt chất 1 có tác dụng gây tiêu hết u đến 50% ở chuột Swiss mang u rắn Sarcoma180 ở liều cao nhất 1g/kg thể trọng, và đạt tỷ lệ 30% ở hai liều thấp hơn là 0,5 và 0,2g/kg thể trọng.
- Hoạt chất 1 có tác dụng làm giảm thể tích khối u rõ rệt trên chuột và tăng thời gian sống thêm so với đối chứng không sử dụng hoạt chất ở tất cả 3 liều lượng thử nhưng cao nhất là liều 1g/kg thể trọng.
KẾT LUẬN
Từ những nghiên cứu in vitro và in vivo đã tiến hành trên 4 hoạt chất meso- Dihydroguaireic acid; Macelignan; Fragransin A và Nectandrin B sàng lọc được chúng tôi rút ra những kết luận sau:
meso-dihydroguairetic acid có hoạt tính kháng u khi thử tác dụng trên 08 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng 10 μM đến 33,4 μM, trong đó tác dụng mạnh nhất là trên dòng tế bào ung thư phổi H358 (IC50 = 10,11 µM). Chế phẩm không gây độc cho dòng tế bào thường MDCK với tỷ số tăng sinh đạt 87,76% so với đối chứng khi thử ở nồng độ cao nhất (30 µM). meso-dihydroguairetic acid có tác dụng rõ rệt trong việc làm giảm thể tích và
gây tan khối cầu spheroid của dòng tế bào MCF7. Chỉ một ngày sau khi tra chất 1 thể tích khối spheroid đã giảm đáng kể ở tất cả các nồng độ 10, 15, 20, 30 µM. Đến ngày thứ 4 thì thể tích khối cầu spheroid gần như không đáng kể (chỉ còn vài 6-7% so với ngày thứ nhất).
meso-dihydroguairetic acid gây tiêu hết u đến 50% trên chuột nhắt trắng Swiss mang u rắn Sar180 ở liều thử thuốc cao nhất 1g/kg thể trọng, và đạt tỷ lệ 30% ở hai liều thấp hơn là 0,5 và 0,2g/kg thể trọng. Chất thử còn có tác dụng làm tăng thời gian sống thêm ở chuột so với đối chứng không sử dụng chế phẩm ở tất cả 3 liều lượng thử, kéo dài nhất là liều 1g/kg thể trọng. Chuột ở lô ĐCUT chỉ sau 35 ngày kể từ khi tạo u chuột đã chết hoàn toàn, ở các lô sử dụng chất số 1 còn 30% số chuột vẫn sống đến ngày thứ 60.
Những kết quả nghiên cứu trên có thể kết luận hoạt chất meso-dihydroguairetic acid (1) có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư in vitro và in vivo. Tuy nhiên cơ chế tác dụng của hoạt chất này vẫn chưa được biết rõ. Hy vọng những kết quả này sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu tiếp theo về cơ chế tác dụng và định hướng phát triển của hoạt chất 1 trong tương lai.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Đỗ Trung Đàm (1995), Thuốc chữa ung thư, NXB Y học, Hà Nội.
2. Lê Xuân Hải (2009), Đánh giá độc tính và tác dụng kích thích miễn dịch, chống gốc tự do của cao thuốc thảo dược VID, Luận án tiến sĩ.
3. Hiệp hội chống ung thư UICC (1999), Ung thư học lâm sàng, NXB Y học, Hà Nội.
4. Bùi Văn Lệ, “Ảnh hưởng chất điều hoà tăng trưởng thực vật và đường saccarose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa”, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 9 (6), tr59.
5. Đỗ Tất Lợi (2003), Các cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.
6. Chu Văn Mẫn (2009), Tin học trong công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội.
7. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ sinh học trên người và động vật, NXB Giáo dục, TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Thị Quỳ (1993), Gây tạo mô hình u báng thực nghiệm và thử tác dụng phòng chống ung thư của một số hoạt chất tự nhiên và tổng hợp, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
9. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Kamenarka.Z, Bankova.V, Popov.S, Zvetkova.E, Lê Mai Hương (2011), “Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn Alcoloid từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crium latifolium)”, Tạp chí Dược học số 11, tr21-23.
10.Trần Công Yên (1990), Tế bào ung thư - một mục tiêu tấn công chủ yếu của Sinh – Y học hiện đại, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tài liệu đánh máy lưu hành nội bộ.
11.http://www.thuocbietduoc.com.vn/tin-tuc-11252-2-5/ung-thu-do-loi-song- tang-chong-mat.aspx0
12.http://wvww.thuoc-suckhoe.com/khainiem/BAIVIET/phanloai 026.htm 13.http://www.ungthu.net
Tiếng Anh
14.Chung, J.Y., Choo, J.H., Lee, M.H., Hwang, J.K (2006), “Anticariogenic activity of macelignan isolated from Myristica fragrans (nutmeg) against Streptococus mutans”, Phytomedicine, 13, 261-266. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
15.Forrest, J.E., Heacock, R.A., Forrest, T.P. (1974), “Diarylpropanoids from nutmeg and mace”, Myristica fragrans Houtt, 2, 205-209.
16.Freshney, R.I. (2005), “Culture of Animal Cells”, A Manual of Basic Technique, 5th edition.
17.Gils, C.V., Alan Cox, P. (1994), “Ethnobotany of nutmeg in the Spice Islands” , J. Ethnopharmacol, 42, 117-124.
18.Hanahan, D., Weinberg R.A. (2000), "The Hallmarks of Cancer". Cell, 100, 57–70.
19.Kwon, H.S., Kim, M.J., Jeong, H.J., Yang, M.S., Park, K.H., Jeong, T.S., Lee, W.S. (2008), “Low density lipoprotein (LDL)-antioxidant lignans from
Myristica fragrans seeds”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 18, 194-198. 20.Masters, J.R.W. (2002), Cancer cell lines, Vol.I.
21.Morita, T., Jinno, K., Kawagishi, H., Arimoto, Y., Suganuma, H., Inakuma, T., Sugiyama, K. (2003), “Hepatoprotective effect of myristicin from nutmeg (Myristica fragrans) on lipopolysaccharide/d-galactosamine-induced liver injury”, J. Agric. Food Chem., 51, 1560-1565.
22.Laboratory, T.J. (2008), Mouse Models for Cancer Research.
23.Olajide, O.A., Ajayi, F.F., Ekhelar, A. I., Awe, S.O., Makinde, J.M., Alada, A.R. (1999), “Biological effects of Myristica fragrans (nutmeg) extract”,
24.Oliveros – Belardo, V.A., Masilugan, V., Cardeno, F., Devera, E., Delacruz, E., Valmonte. J. (1972), “Possible antitumor conitituent of Carica papaya”,