1 RM588 GTTGCTCTGCCTCACTCTTG AACGAGCCAACGAAGCAG
2.3.4.2.Kỹ thuật PCR
Là kỹ thuật cơ bản được sử dụng trong nghiên cứu này với các chỉ thị SSR liên kết gen kháng rầy nâu
Bảng 2.6. Thành phần của mỗi phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích ( l) 1 H2O cất khử trùng 8.95 2 Buffer 10X 1,5 3 MgCl2 (50mM) 0,45 4 dNTP (1mM) 1,0
5 Taq DNA polymeraza (5U) 0,1
6 Primer forward 5 M 0,5
7 Primer Revert 5 M 0,5
8 DNA (35ng/ l) 2,0
Tổng thể tích: 15
Phản ứng PCR được tiến hành trong ống eppendorf 0,2ml và thực hiện trên máy Mastercycler chương trình chạy như sau:
Bảng 2.7. Chƣơng trình chạy phản ứng PCR
Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian
(phút) Số chu kỳ Tác dụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 34 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 94 55-65 72 1 1 2 35 Biến tính Gắn mồi Tổng hợp 3 72 7 1 Tổng hợp 4 10 Bảo quản
2.3.4.3.Kỹ thuật làm gel và điện di kiểm tra sản phẩm Gel Agarose:
- Agarose 1%
- TBE (Tris base, Boric acid, EDTA) 0,5x. - Ethidium bromide 10mg/ml (Stock solution)
Gel Acrylamide 4,5%:
a. Chuẩn bị kính
- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nước cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.
- Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch. Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn.
- Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Bind silane) được tạo thành bằng cách thêm 2 l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid.
- Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần.
- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm. b. Chuẩn bị gel polyacrylamide
Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide: bisacrylamide). (Bảng 2.8) Bảng 2.8. Dung dịch gốc 40% acrylamide Thể tích 500ml 1000ml Acrylamide 190g 380g Bis - acrylamide 10g 30g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 35 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.9. Dung dịch acrylamide 4.5%
Lọc dung dịch 4,5% acrylamide qua giấy lọc.
- Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide vào 1 cốc đong 100ml. Thêm 300 l APS10% và 60 l TEMED, trộn đều.
- Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí.
- Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngoài). Dùng kẹp cố định lược.
- Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ. c. Điện di
- Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. - Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 1x vào buồng đệm trên và dưới. - Chạy tiền điện di (pre-run) với cường độ dòng điện là 50 - 60A, công suất 92 - 100W. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên trên ít nhất 5 phút.
Sản phẩm PCR lúc này đã được trộn với 4 l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol).
- Tra vào mỗi giếng 4 l sản phẩm PCR đã được làm biến tính, giếng đầu tiên cho 4 l chỉ thị trọng lượng phân tử. Thời gian tra không kéo dài quá 20 phút để gel không bị nguội đi nhiều.
- Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian khoảng 60-90 phút. Phƣơng pháp nhuộm bạc Thành phần Nồng độ V = 500ml 40% acrylamide/Bis acrylamide 4,5% 56,25ml Urea 42% 210g TBE 10x 1x 50ml
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 36 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Chuẩn bị các dung dịch
- Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid và 900ml nước cất.
- Dung dịch nhuộm (Staining solution) được tạo thành bằng cách hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO3) vào 1 lít nước cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd 37%.
- Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (NaCO3) trong 1 lít nước cất và làm lạnh ở -200C.
Chú ý. (Trước khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd 37% và 200 l natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O).
+Tiến hành nhuộm
Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bước sau: - Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng vào và để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch cho khô.
- Ghi nhận kết quả