C. Giống nhận gen có đặc tính nông sinh học tốt
3.2.ĐÁNH GIÁ ĐA HÌNH CÁC GIỐNG BỐ MẸ QUẦN THỂ CHỌN GIỐNG
Trong nghiên cứu này, các dòng giống lúa nghiên cứu được tách chiết ADN bằng phương pháp dùng CTAB theo protocol của phòng thí nghiệm Di truyền học của trường Đại học Tổng hợp Ghent Bỉ (đã được cải tiến tại Phòng Sinh học Phân tử Viện Di truyền Nông nghiệp).
Hình 3.2. Ảnh thí nghiệm kiểm tra nồng độ và chất lượng ADN của các dòng giống lúa thí nghiệm trên gel agarose 0,8%
Kết quả điện di ADN trên hình 3.2 cho thấy, các mẫu ADN thu được cho băng gọn, nồng độ cao, sáng rõ nét, rất thích hợp cho làm PCR. Độ tinh sạch và nồng độ của ADN sau khi tách được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% cùng với ADN nồng độ chuẩn. Kết quả cho thấy ADN có chất lượng tốt, không bị
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 43 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đứt gãy, nồng độ trong khoảng từ 200 – 300ng/ l có thể dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Dựa trên các kết quả lập bản đồ chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng rầy nâu sử dụng, tiến hành sàng lọc các chỉ thị để tìm chỉ thị đa hình có thể dùng cho chọn giống lúa kháng rầy bằng phương pháp MAS qua các thế hệ.
Bản đồ của gen BphZ do nhóm nghiên cứu Lưu Thị Ngọc Huyền và các ctv lập ra gồm 15 chỉ thị SSR trên NST số 4, với tổng khoảng cách 25cM, tính từ vị trí của chỉ thị RM6997 là 62,2cM trên vai ngắn của NST số 4 đến vị trí của chỉ thị RM17329 là 87,4cM. Trong đó các chỉ thị gần nhất là RM7051, RM3367, RM3839 (nằm ở 1 phía gen kháng, cách gen kháng từ 1,7 tới 3,4 cM) và RM1388, RM1223, RM17235 (nằm ở phía bên kia gen kháng, cách gen kháng từ 1,7 tới 3,2 cM).
Bản đồ gen kháng Bph3 trên vai ngắn của nhiễm sắc thể số 6 được lập bởi tác giả Jirapong và ctv, 2007.
Hình 3.3. Bản đồ phân tử chi tiết gen kháng rầy nâu BphZ
Bên trái: Nhiễm sắc thể số 4
Bên phải: Bản đồ liên kết gen BphZ bao gồm 15 chỉ thị SSR. (khoảng cách: cM) (Lưu Thị Ngọc Huyền, 2003)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 44 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các chỉ thị liên kết gen kháng dùng để đánh giá đa hình các giống bố mẹ được nêu trong bảng 2.2. Trên hình 3.5 đến 3.7, các cặp mồi liên kết gen kháng đã được phân tích đa hình trên các giống bố mẹ. Trên cơ sở kết quả phân tích, cặp mồi RM588, RM190 đã được lựa chọn để sử dụng như những chỉ thị trợ giúp đối với gen Bph3.
Hình 3.5.Kết quả đánh giá đa hình bố mẹ với cặp mồi RM588
Hình 3.6. Kết quả đánh giá đa hình bố mẹ với cặp mồi RM5757 Hình 3.4.Bản đồ phân tử gen kháng rầy nâu Bph3 (Jirapong và ctv 2007)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.7.Kết quả đánh giá đa hình bố mẹ với cặp mồi RM3367
Hình 3.7 cho thấy có đa hình giữa SL với dòng IS với cặp mồi RM3367, có thể sử dụng chỉ thị này để phân tích xác định cây mang chỉ thị liên kết gen kháng. Tương tự như vậy, chỉ thị RM3524 cho đa hình với khá nhiều dòng cho gen và dòng nhận gen kháng và cũng đã được lựa chọn để sử dụng như những chỉ thị trợ giúp trong nghiên cứu đối với gen BphZ.
Hình 3.8. Kết quả phân tích các dòng giống bố mẹ với cặp mồi RM3288.
Thứ tự các giếng: 1- Swa; 2- Q5; 3- KD; 4- KD ĐB; 5- DT38; 6- H2; 7- BT; 8- IR64; 9- SL12; 10- IS1.2; 11- IS1.9;12- IS. 2.1; 13- IS 2.3;14-S2.5; 15- IS2.6; 16- IS 2.7;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 46 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các cặp mồi khác như RM3288, RM6997, RM3735... cũng đã được phân tích. Sau khi xác định được các chỉ thị trợ giúp, tùy theo đa hình giữa các cặp cho và nhận gen kháng, chúng tôi sử dụng vào việc phân tích chỉ thị liên kết gen để xác định các cá thể mang gen kháng qua từng thế hệ con lai hoặc các thế hệ backcross.
Như vậy, phân tích đa hình các chỉ thị với các dòng cho gen và dòng nhận gen kháng đã xác định được các chỉ thị liên kết với các gen kháng hiệu quả được sử dụng làm chỉ thị trợ giúp trong chọn giống lúa kháng rầy nâu, đó là chỉ thị RM586; RM588; RM589; RM190 liên kết gen Bph3 trên NST số 6. Các chỉ thị RM3524; RM1388; RM3367; RM3735; RM5757; RM6997 liên kết gen BphZ trên NST4.
Ngoài những chỉ thị nêu trên, một số các chỉ thị khác nằm về 2 phía của vị trí gen kháng trên cơ sở của bản đồ SSR của lúa cũng đã được phân tích. Nhưng hầu như các chỉ thị này không cho đa hình hoặc rất hiếm đa hình được tìm thấy giữa các cặp cho và nhận gen.
Kết quả tìm các chỉ thị phân tử liên kết gen kháng đã xác định RM588, RM190, RM3524, RM3367, RM3735, RM5757 cho đa hình giữa dòng cho gen IS và giống nhận gen SL12. Các chỉ thị này đã được sử dụng như những chỉ thị trợ giúp trong chọn giống kháng rầy nâu với tổ hợp lai SL12/IS.