2.3.1.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất
Thân và lá Vối đường thu hái, phơi khô và ngâm chiết kỹ 3 lần với dung môi Ethanol 96%. Lọc dịch chiết ethanol qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết tổng ethanol.
Phân tán cao chiết ethanol trong nước cất và tạo các phân đoạn hóa học bằng nhựa Macropourous HP-20 lần lượt với các dung môi nước, ethanol 25%, ethanol 50% và ethanol 96%. Các phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu các cao phân đoạn tương ứng.
Các phân đoạn có hoạt tính Vối đường
(MyrsineseguiniiH. Lev)
Cao toàn phần
Các cao phân đoạn
Các chất tinh khiết Chiết xuất Chiết phân đoạn Phân lập Xác định cấu trúc Thử tác dụng ức chế sinh NO của tế bào RAW 264.7
17
2.3.1.2. Phương pháp phân lập các chất
Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột với các cơ chế chủ yếu là cột hấp phụ, cột trao đổi ion và cột lọc qua gel. Phương pháp nhồi cột ướt được sử dụng chủ yếu đối với tất cả các loại sắc ký cột [3], [5], [7]. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng để theo dõi quá trình rửa giải.
a. Sắc ký cột hấp phụ
Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu trúc trong hỗn hợp với 2 pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua cột, pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh. Nhờ vậy mà có thể triển khai liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau với độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh [3], [5], [7].
Chất nhồi cột là Silica gel pha thường (Silica gel 60, 0,040-0,063 mm (230- 400 mesh ASTM), Merck) và Silica gel pha đảo Cosmosil C-18.
b. Sắc ký lọc gel
Nguyên tắc: Sắc ký lọc gel là phương pháp phân tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thước của chúng thông qua sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung môi pha động và cùng dung môi đó được pha tĩnh giữ trong các lỗ xốp của gel. Khoảng kích thước của lỗ gel xác định kích thước phân tử được phân tách qua quá trình sắc ký [3], [5], [7].
Sử dụng chất nhồi cột là Sephadex LH-20. c. Sắc ký lớp mỏng
Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silicagel pha thường (Silica gel 60 F254, Merck) và pha đảo (YMC-RP18 F254 Merck).
Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích dựa trên cơ chế hấp phụ. Chất phân tích sau khi thấm lên bản mỏng sẽ di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định. Trong quá trình chạy sắc ký, phụ thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của các
18
thành phần trong chất phân tích sẽ tạo ra các vệt sắc ký ở các vị trí khác nhau [3], [5], [7].
Các chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 366nm hoặc dùng thuốc thử Vanilin/H2SO4 hay dung dịch H2SO4 10% (v/v) pha trong ethanol phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt cao trong vòng vài giây đến vài phút cho đến khi hiện màu [3], [5], [7].