Quá trình phân lập được thực hiện ở từng cao phân đoạn có hoạt tính. Trong khuôn khổ của đề tài khoá luận, phân đoạn PĐ 50 được tiến hành phân lập với quá trình như sau:
4,8g cao phân đoạn EtOH 50% (PĐ 50) được hòa tan trong methanol trong bình cầu, thêm silica gel khô vào dung dịch này. Lắc để đảm bảo tất cả silica gel phân tán đều trong dung dịch. Bay hơi nhẹ dung môi đến khi thu được silica khô và tơi. Chuyển silica gel khô đã bão hòa mẫu vào cột và triển khai trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần là n-hexan – ethyl acetat (2:3, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7, 1:10, 0:1) và ethyl acetat – methanol (1:0, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1,1:3, 1:8,0:1). Theo dõi quá trình triển khai bằng TLC, các phân đoạn có sắc ký đồ tương tự nhau được gộp chung thu được 6 phân đoạn ký hiệu là P1 ÷ P6.
Phân đoạn P5 được tiến hành phân lập trực tiếp trên cột sắc ký pha đảo Cosmosil C-18, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH –H2O (1:1, v/v) thu được 3 phân đoạn P5.1 ÷ P5.3. Phân đoạn P5.2 được tinh chế bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 với pha động là dung môi MeOH. Bằng phương pháp HPLC điều chế (pha động: 14% acetonitril trong H2O chứa 0,1% acid formic; nhiệt độ cột: 45
℃), tiếp tục tinh chế và thu được các hợp chất VD-1, VD-2, VD-3.
Các bước phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn EtOH 50% được thể hiện ở hình 3.2.
26 P5.1
HPLC
Pha động: 14% ACN trong H2O chứa 0,1% acid formic
Nhiệt độ cột: 45℃ P5.2.1 Reverse phase MeOH-H2O (1:1, v/v) Normal phase Hexan-EA (2:3-1:0, v/v) EA-MeOH (1:0-0:1, v/v) Sephadex LH-20 MeOH P5.2.2 P5.3 P5.2 PĐ 50 (4,8g) P1 ÷ P4 P5 P6 VD-1 (5,2mg) VD-3 (3,2mg) VD-2 (13,5mg)
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập 3 hợp chất VD-1, VD-2, VD-3 từ thân và lá
Vối đường (Myrsine seguinii H.Lev)
Nhận xét: Từ phân đoạn EtOH 50% (4,8g) phân lập được 3 hợp chất VD-1 (5,2mg), VD-2 (13,5mg), VD-3 (3,2mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt. Trong khuôn khổ của đề tài này, hợp chất VD-2 với lượng chất phân lập lớn nhất sẽ được tiến hành đo phổ MS, phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR để nhận dạng cấu trúc.