ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7
2.3.3.1. Nguyên tắc
NO là chất trung gian hóa học được tạo ra tại các vị trí viêm bởi một enzym cảm ứng gọi là NOS. LPS đóng vai trò là tác nhân gây viêm, kích thích tế bào đại thực bào RAW 264.7 giải phóng ra các chất trung gian gây viêm, trong đó có NO. Do đó, định lượng NO là một trong những cách để đánh giá quá trình viêm và phản ánh mức độ viêm [47].
Mẫu thử được cho là có tác dụng khi ức chế giải phóng NO có ý nghĩa so với mẫu chứng nhưng không ảnh hưởng đến mức độ sống sót của tế bào RAW 264.7 [2]. Do đó, để đánh giá tác dụng của mẫu thử trên mô hình thực nghiệm, cần đánh giá khả năng ức chế giải phóng NO từ tế bào đại thực bào RAW 264.7 bị kích thích bởi LPS và đánh giá mức độ gây độc của mẫu thử đối với tế bào thực nghiệm RAW 264.7.
Mô hình đánh giá khả năng ức chế giải phóng NO trên tế bào RAW 264.7 được cung cấp bởi phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
19
2.3.3.2. Nuôi cấy tế bào
Dòng tế bào RAW 264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2mM L-glutamine, 10mM HEPES, và 1mM natri pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỷ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37˚C, 5% CO2.
2.3.3.3. Tiến hành đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu thí nghiệm
Tế bào RAW 264.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 × 105 tế bào/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37˚C và 5% CO2 trong 24 giờ.
Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3 giờ.
Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2 giờ trước khi kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1µg/mL) trong 24 giờ.
Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dương được sử dụng là NG – Methyl L-arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0,8µg/mL.
Nitrite (NO2-) được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (PromegaCooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 giếng mới và được thêm vào 100μL thuốc thử Griess: 50μL sulfanilamide 1% (kl/tt) trong acid phosphoric 5% (tt/tt) và 50μL N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride 0,1% (kl/tt) pha trong nước.
Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 540nm. Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng.
Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).
20
Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức: % ức chế =100% - (hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS)*100
Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
2.3.3.4. Phép thử sinh học xác định khả năng gây độc đối với tế bào RAW 264.7
bằng MTT
Chất thử (20µl) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ tương tự nồng độ của thí nghiệm NO.
Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút 180µl tế bào vào các giếng của khay 96 giếng đã có chất thử. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO 10%.
Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37˚C và 5% CO2, nuôi trong thời gian 72 giờ.
Sau 72 giờ, 10µl MTT (nồng độ cuối cùng là 5mg/ml) được cho vào mỗi giếng.
Sau 4 giờ, loại bỏ môi trường, tinh thể formazan được hòa tan bằng 50µl DMSO 100%.
Giá trị OD đo ở bước sóng 540nm bằng máy microplate reader. Lượng tế bào sống sót được tính theo công thức:
OD (chất thử) – OD (đối chứng trắng)
% tế bào sống sót = x 100%
21
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Chiết các phân đoạn từ thân và lá Vối đường
3.1.1. Xử lý mẫu
Thân và lá Vối đường sau khi thu hái được rửa sạch, phơi, sấy khô ở nhiệt độ 50 - 55℃, xay nhỏ. Lượng dược liệu mang đi chiết xuất là 2kg.
3.1.2. Chiết xuất cao toàn phần
Toàn bộ dược liệu được cho vào bình chiết và làm ẩm bằng ethanol 96%, đậy kín và để yên cho đến khi toàn bộ lượng dược liệu thấm đều dung môi và trương nở hoàn toàn. Sau đó, thêm ethanol 96% vừa đủ ngập dược liệu, cách bề mặt dược liệu khoảng 3cm, để ngâm ở nhiệt độ phòng. Tiến hành chiết 3 lần, mỗi lần chiết trong 24 giờ với 5 lít ethanol 96%. Dịch chiết thu được đem lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao ethanol toàn phần (224,99g).
3.1.3. Chiết xuất các phân đoạn
Ngâm trương nở hạt nhựa Macroporous HP-20 trong ethanol. Sau đó cho toàn bộ hạt đã trương nở lên cột. Ổn định cột bằng nước cất. Phân tán toàn bộ cao toàn phần vào khoảng 2 lít nước cất rồi đưa mẫu lên cột. Tiến hành giải hấp phụ lần lượt với các dung môi nước cất, ethanol 25%, ethanol 50% và ethanol 96% sau đó cô thu hồi dung môi thu được cao các phân đoạn nước (PĐ H2O: 25,18g), phân đoạn ethanol 25% (PĐ 25: 59,92g), phân đoạn ethanol 50% (PĐ 50: 14,8g), phân đoạn ethanol 96% (PĐ 96: 7,52g).
22
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ thân và lá Vối đường (Myrsine
seguinii H. Lev)
3.2. Đánh giá tác dụng chống viêm in-vitro của cao toàn phần và cao các phân đoạn phân đoạn
Tiến hành thử tác dụng chống viêm in-vitro trên mô hình xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 đối với cao toàn
Dịch chiết ethanol 96%
Cao chiết ethanol 96% (224,99g)
Dịch chiết nước
Hoạt chất/cột Bột dược liệu
(2,0kg)
Ngâm lạnh với ethanol 96%
24h x 3 lần
Cô loại dung môi
Nước cất
Cột HP-20, hấp phụ
Giải hấp phụ bằng nước, ethanol 25%, ethanol 50%, ethanol 96%
Cất thu hồi dung môi
Cao phân đoạn H2O (PĐ H2O)
25,18g
Cao phân đoạn EtOH 25%
(PĐ 25) 59,92g
Cao phân đoạn EtOH 96%
(PĐ 96) 7,52g Cao phân đoạn
EtOH 50% (PĐ 50)
14,8g
CC, Silica gel, Ethyl acetat – methanol (0:1-1:0, v/v)
23
phần và cao các phân đoạn Vối đường bao gồm PĐ H2O, PĐ 25, PĐ 50, PĐ 96 ở các nồng độ 2000, 1000, 500 và 100 µg/ml.
Tỷ lệ % ức chế NO của các mẫu thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khả năng ức chế sản sinh NO (%) của các mẫu cao Vối đường
(Myrsine seguinii H. Lev)
Mẫu thử Chứng dương Nồng độ (µg/ml) Cao toàn phần PĐ H2O PĐ 25 PĐ 50 PĐ 96 Nồng độ (µg/ml) L-NMMA 2000 98,91 77,90 - - - 100 95,69 1000 91,68 41,14 88,62 74,40 101,09 20 75,91 500 64,33 33,26 62,36 70,90 81,18 4 24,14 100 9,41 15,97 46,83 15,97 15,10 0,8 13,93 IC50 348,20 ±11,23 1195,54 ±18,98 195,91± 5,76 173,93± 20,23 160,47± 11,24 IC50 8,93±0,79
Cao toàn phần và cao các phân đoạn PĐ H2O, PĐ 25, PĐ 50 và PĐ 96 đều có thể hiện hoạt tính ức chế NO sản sinh trong mô hình thực nghiệm với các giá trị IC50 dao động từ 160,47 đến 1195,54 µg/ml. Đặc biệt, các cao phân đoạn PĐ 25, PĐ 50 và PĐ 96 có giá trị IC50 nhỏ sẽ được tập trung nghiên cứu phân lập chất tinh khiết theo định hướng thử hoạt tính ức chế NO trên mô hình này.
Trong khuôn khổ của khóa luận tốt nghiệp, đề tài tập trung vào phân lập phân đoạn PĐ 50 trước và đánh giá hoạt tính của chất tinh khiết được phân lập từ phân đoạn này.
Để đánh giá các mẫu cao dược liệu có khả năng ức chế giải phóng NO hay gây độc tế bào RAW 264.7 làm giảm lượng NO, tiến hành đánh giá khả năng gây độc tế bào hay khả năng sống sót của tế bào tương ứng với các mẫu cao dược liệu ở 3 nồng độ khác nhau là 2000, 1000 và 500 µg/ml thông qua MTT.
24 Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tỷ lệ tế bào RAW 264.7 còn sống khi tiếp xúc với các mẫu cao Vối
đường (Myrsine seguinii H. Lev).
Mẫu thử Chứng dương Nồng độ (µg/ml) Cao toàn phần PĐ H2O PĐ 25 PĐ 50 PĐ 96 Nồng độ (µg/ml) L- NMMA 2000 35,72 100,23 - - - 100 89,92 1000 40,73 114,54 21,58 64,11 52,06 20 99,65 500 96,45 38,03 121,13 88,45
Cao toàn phần ở nồng độ cao (1000 và 2000 µg/ml) làm chết tế bào một cách đáng kể, tỷ lệ tế bào RAW 264.7 sống sót lần lượt là 35,72% và 40,73%. Khi ở mức liều 500 µg/ml, mẫu nghiên cứu này ít có ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào (96,45%).
Phân đoạn H2O không làm giảm đáng kể phần trăm tế bào sống sót so với mẫu chứng ở mức liều 2000µg/ml (100,23%).
Ở các nồng độ 2000, 1000, 500 µg/ml, phân đoạn EtOH 25% gây độc một lượng lớn tế bào RAW 264.7. Tỷ lệ tế bào sống sót chỉ tăng lên 96,51% (>80%) khi giảm nồng độ xuống còn 100 µg/ml.
Đối với phân đoạn EtOH 50%, mức độ gây độc tế bào ở mức đáng kể khi nồng độ của mẫu nghiên cứu lớn hơn 1000 µg/ml. Khi mức liều còn 500 µg/ml, không thấy có sự giảm đáng kể lượng tế bào so với mẫu chứng với phần trăm tế bào sống sót là 121,13%. Tương tự với phân đoạn EtOH 96%, tỷ lệ tế bào sống sót ở nồng độ 500 µg/ml là 88,45% (>80%).
25
3.3. Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cao PĐ 50 thân và lá Vối đường đường
3.3.1. Quá trình phân lập từ cao phân đoạn PĐ 50
Quá trình phân lập được thực hiện ở từng cao phân đoạn có hoạt tính. Trong khuôn khổ của đề tài khoá luận, phân đoạn PĐ 50 được tiến hành phân lập với quá trình như sau:
4,8g cao phân đoạn EtOH 50% (PĐ 50) được hòa tan trong methanol trong bình cầu, thêm silica gel khô vào dung dịch này. Lắc để đảm bảo tất cả silica gel phân tán đều trong dung dịch. Bay hơi nhẹ dung môi đến khi thu được silica khô và tơi. Chuyển silica gel khô đã bão hòa mẫu vào cột và triển khai trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần là n-hexan – ethyl acetat (2:3, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7, 1:10, 0:1) và ethyl acetat – methanol (1:0, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1,1:3, 1:8,0:1). Theo dõi quá trình triển khai bằng TLC, các phân đoạn có sắc ký đồ tương tự nhau được gộp chung thu được 6 phân đoạn ký hiệu là P1 ÷ P6.
Phân đoạn P5 được tiến hành phân lập trực tiếp trên cột sắc ký pha đảo Cosmosil C-18, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH –H2O (1:1, v/v) thu được 3 phân đoạn P5.1 ÷ P5.3. Phân đoạn P5.2 được tinh chế bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 với pha động là dung môi MeOH. Bằng phương pháp HPLC điều chế (pha động: 14% acetonitril trong H2O chứa 0,1% acid formic; nhiệt độ cột: 45
℃), tiếp tục tinh chế và thu được các hợp chất VD-1, VD-2, VD-3.
Các bước phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn EtOH 50% được thể hiện ở hình 3.2.
26 P5.1
HPLC
Pha động: 14% ACN trong H2O chứa 0,1% acid formic
Nhiệt độ cột: 45℃ P5.2.1 Reverse phase MeOH-H2O (1:1, v/v) Normal phase Hexan-EA (2:3-1:0, v/v) EA-MeOH (1:0-0:1, v/v) Sephadex LH-20 MeOH P5.2.2 P5.3 P5.2 PĐ 50 (4,8g) P1 ÷ P4 P5 P6 VD-1 (5,2mg) VD-3 (3,2mg) VD-2 (13,5mg)
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập 3 hợp chất VD-1, VD-2, VD-3 từ thân và lá
Vối đường (Myrsine seguinii H.Lev)
Nhận xét: Từ phân đoạn EtOH 50% (4,8g) phân lập được 3 hợp chất VD-1 (5,2mg), VD-2 (13,5mg), VD-3 (3,2mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt. Trong khuôn khổ của đề tài này, hợp chất VD-2 với lượng chất phân lập lớn nhất sẽ được tiến hành đo phổ MS, phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR để nhận dạng cấu trúc.
3.3.2. Xác định cấu trúc hợp chất VD-2 phân lập được từ phân đoạnPĐ 50
27
ESI-MS (phụ lục 3) cho pic ion giả phân tử m/z [M–H]– = 449,25 gợi ý VD-2 có công thức phân tử C21H22O11 (tương ứng với khối lượng phân tử M=450).
Phổ 1H-NMR (phụ lục 4) của VD-2 cho các tín hiệu đặc trưng của hợp chất flavonon với tín hiệu hai 2 proton vòng thơm ở vị trí meta tại δH 5,88 (1H, overlap, H-8) và 5,84 (1H, overlap, H-6), 3 proton thuộc hệ ABX tại δH 6,46 (1H, s, H-2′), 6,73 (1H, s, H-6′), 6,88 (1H, s, H-5′) và các tín hiệu thuộc vòng pyran tại δH 5,09 (1H, d, J = 8,9 Hz, H-2), 4,62 (1H, d, J = 9,8 Hz, H-3).
Phổ 13C-NMR (phụ lục 5) cho 15 tín hiệu carbon bao gồm 12 tín hiệu vòng thơm δC 95,3-167,4 ppm trong đó có các tín hiệu carbon gắn với oxy tại δC 163,5 (C-5), 167,4 (C-7), 162,5 (C-9), 146,0(C-4′), 145,3 (C-3′), 3 tín hiệu vòng pyran tại δC 82,8 (C-2), 75,7 (C-3) và 1 tín hiệu cacbon mang nhóm keton 194,3 (C-4).
Phân mảnh đường được xác định là rhamnose dựa vào vào sự tồn tại của nhóm methyl doublet trên phổ proton tại δH 1,05 (3H, overlap), tín hiệu anomeric proton tại δH 4,03 (1H, overlap) và các proton 4,28 (1H, m), 3,58 (1H, overlap), 3,41 (1H, overlap), 3,34 (overlap, m). Phổ carbon cũng cho các tín hiệu tương ứng của anomeric cacbon tại 101,0 (C-1’’), methyl cacbon tại 17,8 (C-6’’) và 4 tín hiệu cacbon mang oxy tại 70,1 (C-2’’), 70,2 (C-3’’),70,5 (C-4’’), 69,0 (C-5’’). Tín hiệu proton H-2 gợi ý hai proton H-2 và H-3 ở hai phía.
Kết quả so sánh dữ liệu phổ của VD-2 và chất đối chiếu được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR của VD-2 và chất đối chiếu [19]
28 Vị trí Hợp chất VD-2 Astilbin [19] δCb,d δHb,d δCa,c δHa,c 2 82,8 5,09 (1H, d, 9,8 Hz) 83,96 5,08 (1H, d, 10,8 Hz) 3 75,7 4,62 (1H, d, 9,8 Hz) 78,56 4,58 (1H, d, 10,4 Hz) 4 194,3 196,00 5 163,5 165,52 6 100,1 5,84 (1H, overlap) 97,37 5,89 (1H, d, 2,0 Hz) 7 167,4 168,62 8 95,3 5,88 (1H, overlap) 96,25 5,91 (1H, d, 2,0 Hz) 9 162,5 164,11 10 100,1 102,48 1’ 127 129,18 2’ 115,4 6,46 (1H, m) 116,30 6,59 (1H, d, 1,6 Hz) 3’ 145,3 14654 4’ 146,0 147,38 5’ 114,8 6,73 (1H, s) 115,46 6,85 (1H, m) 6’ 118,9 6,88 (1H, s) 120,48 6,85 (1H, m) Rha 1’’ 101,0 4,03 (1H, overlap) 102,14 4,04 (1H, d, 1,6 Hz) 2’’ 70,1 4,28 (1H, m) 71,77 4,28 (1H, m) 3’’ 70,2 3,58 (1H, overlap) 72,15 3,67 (1H, dd, 9,2; 3,2Hz) 4’’ 70,5 3,41 (1H, overlap) 73,79 3,53 (1H, dd, 3,2; 1,6 Hz) 5’’ 69,0 3,34 (overlap, m) 70,50 3,32 (overlap, m) 6’’ 17,8 1,05 (overlap) 17,85 1,18 (3H, d, 6,0 Hz)
29
Trên cơ sở các số liệu phổ NMR, MS kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [19], hợp chất VD-2 được xác định là 2R,3R-taxifolin 3-O-α-L- rhamnopyranoside còn được gọi là astilbin có cấu trúc như hình 3.3.
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất VD-2
3.4. Thử tác dụng chống viêm in-vitro của các hợp chất phân lập được
Áp dụng mô hình xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 đối với 3 chất tinh khiết phân lập được là VD-1, VD-2, VD-3 ở các nồng độ khác nhau, sử dụng đối chứng dương là NG-Methyl L- arginine acetate (L-NMMA). Đồng thời, để đánh giá các dải nồng độ của các mẫu thí nghiệm có gây độc tế bào RAW 264.7 làm giảm lượng tế bào dẫn đến giảm lượng NO tiết ra gây ra tình trạng dương tính giả hay không, tiến hành đánh giá khả năng gây độc tế bào hay khả năng sống sót của tế bào khi tiếp xúc với các mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau thông qua MTT.
30
Bảng 3.4. Khả năng ức chế sản sinh NO và gây độc tế bào RAW 264.7 của
các mẫu chất tinh khiết phân lập được từ cây Vối đường (Myrsine seguinii
H. Lev) VD-1 VD-2 VD-3 L-NMMA Nồng độ (µg/ ml) % ức chế NO % tế bào sống Nồng độ (µg/ ml) % ức chế NO % tế bào sống Nồng độ (µg/ ml) % ức chế NO % tế bào sống Nồng độ (µg/ ml) % ức chế NO % tế bào sống 100 51,42 100,00 250 - - 64,0 52,52 - 100 97,81 87,20 20 24,73 101,69 50 30,85 94,76 12,8 31,29 96,23 20 79,32 100,71 4 17,29 10 20,35 96,51 2,56 24,51 97,46 4 25,14 0,8 -1,97 2 8,32 0,512 13,13 0,8 11,06 IC50 98,05 ±3,23 IC50 >250 IC50 55,51 ±3,15 IC50 8,01 ±0,85
Mẫu VD-1 thể hiện khả năng ức chế giải phóng NO yếu hơn so với mẫu VD-3 với giá trị IC50 của hai mẫu chất lần lượt là 98,05±3,23 và 55,51±3,15