2
3.3.4. Sàng lọc đợt IV
Các kết quả trình bày trong hình 3.8 cho thấy khả năng hạ đường huyết của các 5 mẫu thực vật trong đợt sàng lọc cuối cùng.
Hình 3.8. Đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị
bằng cao chiết thực vật
Ghi chú: * p < 0,01 (p so với lô đối chứng ở cùng thời điểm)
Trong số 5 mẫu cao chiết đem sàng lọc chỉ có mẫu cao chiết giảo cổ lam và lá đắng cho thấy khả năng hạ đường huyết đáng kể ở chuột ĐTĐ type 2. Chuột sau khi uống giảo cổ lam đường huyết giảm 58,86% và lá đắng giảm 56,21%. Trong khi đó chuột uống cao chiết lá sen có tác dụng thay đổi nồng độ đường huyết nhưng không ổn định, mang tính ngẫu nhiên không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Lược vàng và lá sa kê không có khả năng hạ đường huyết thậm chí đường huyết còn tăng so với thời điểm ban đầu.
Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu về khả năng hạ đường huyết của lá đắng trên mô hình chuột ĐTĐ type 2 được thực hiện lần đầu tiên. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi về hoạt tính hạ đường huyết của cao chiết lá đắng là hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đó trên của các tác giả trên thế giới [35]. Nhóm tác giả Asante đã chứng minh rằng cao chiết cồn của lá đắng làm giảm đáng kể nồng độ đường huyết ở chuột bị ĐTĐ, hơn nữa phân tích mô bệnh học cho thấy cao chiết có hiệu quả cải thiện của những bệnh lý gây ra bởi STZ trong tuyến tụy và gan. Đáng kể nhất là sự tái sinh của các tế bào βcủa các đảo tụy ở chuột ĐTĐ được điều trị [35]. Các nghiên
cứu khác cũng cho rằng coumarin, flavonid, lactones sesquiterpen, edotide là các chất tạo ra khả năng chống ung thư của lá đắng, cao chiết chloroform của lá đắng có tác dụng chống ung thư mạnh. Flavonoid được biết đến là chất chống oxy hoá tốt và
19.53 21.56 22.47 20.39 22.37 19.97 25.87 9.44 8.87 25.4 20.63 26.42 0 5 10 15 20 25 30 ĐC Lá đắng Giảo cổ lam Lược vàng Lá sen Sa kê N ồn g độ đ ư ờn g hu yế t (m m ol /l ) 0 giờ 21 ngày * *
luteolin (một flavonoid được tìm thấy trong lá đắng) đã được báo cáo là một chất chống oxy hoá [85].
Một nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng cao chiết ethanol của giảo cổ lam ức chế hoạt động của protein tyrosine phosphatase 1B (PTP-1B), có thể tăng cường độ nhạyinsulin và do đó cải thiện dung nạp glucose [104]. Ngoài ra, giảo cổ lam đã cho thấy giảm cả tăng đường huyết và tăng lipid máu ở chuột béo phì Zucker [104].
Các phần phân đoạn saponin thu được từ giảo cổ lam giảm đáng kể nồng độ đường huyết ở chuột ĐTĐ, phanoside được phân lập từ giảo cổ lam kích thích sự giải phóng insulin từ các đảo tụy [83]. Ngoài ra cao chiếtcủa giảo cổ lam trong nghiên cứu lâm sàng gần đây đã được chứng minh như là một một nguồn thảo dược an toàn và hiệu quả chống lại bệnh ĐTĐ ở những bệnh nhân ĐTĐ type 2 mới được chẩn đoán và có
độ nhạy insulin cao [104]. Bên cạnh đó các gypenoside từ giảo cổ lam cải thiện sự chuyển hóa lipid và có lợi trong điều trị các khối u [83].
Như vậy, trong quá trình sàng lọc 20 mẫu thực vật chúng tôi nhận thấy rằng có 8 mẫu thực vật cho kết quả hạ đường huyết tốt trên mô hình chuột ĐTĐ type 2:
- Lá chè dây - Quả chuối hột
- Hạt đu đủ - Lá đu đủ
- Lá dây thìa canh - Lá và thân cỏ ngọt
- Giảo cổ lam - Lá đắng
Tuy nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2 uống 8 mẫu caochiết thực vật này chưa về lại so với mức bình thường, nhưng với mức đường huyết ban đầu của chuột khá cao (thường trên 16 mmol/l, có trường hợp chuột nhắt ĐTĐ type 2 có nồng độ đường huyết 31 mmol/l) thì kết quả thu được hoàn toàn hợp lý.
3.4. Kết quả nghiên cứu cao chiết chè dây và lá đắng
Qua điều tra, mẫu lá chè dây và lá đắng là hai trong số 8 mẫu thực vật có hoạt tính hạ đường huyết. Qua tham khảo tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nước về hai mẫu thực vật này là chưa được nghiên cứu ở Việt Nam, riêng đối với chè dây là chưa có bất kì nghiên cứu nào trên thế giới về hoạt tính hạ đường huyết vì vậy chúng tôi quyết định chọn chúng cho các nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính chống ĐTĐ:
- Ảnh hưởng của của cao chiết chè dây và lá đắng lên kết quả mô bệnh học của tụy và gan.
- Hiệu quảhạ đường huyết của các cao chiết phân đoạn.
- Phân lập và xác định cấu trúc các hợp tinh sạch từ các cao chiết phân đoạn có hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất.
- Nghiên cứu hiệu quả ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của các hợp chất tinh sạch.
- Nghiên cứu hiệu quả ảnh hưởng của các hợp chất tinh sạch đến quá trình sinh các cytokine tiền viêm (TNF-α, IL-6, IL-8), cytokine kháng viêm (IL-10) và tác dụng khôi phục biểu hiện hai protein pIRS-1 và pY20 của tế bào.
3.4.1. Ảnh hưởng của cao chiết chè dây và lá đắng lên kết quả mô bệnh họccủa tụy và gan của tụy và gan
3.4.1.1. Ảnh hưởng lên cấu trúc mô tụy
Để kiểm tra ảnh hưởng của cao chiết chè dây đến tình trạng cấu trúc mô tụy của chuột, chúng tôi tiến hành đánh giá đại thể tiêu bản mô bệnh học của chuột ĐTĐ type 2 ở các lô thí nghiệm sau khi cho uống 500 mg/kg chè dây và lá đắng, kết quảđược trình bày ở hình 3.9.
Hình 3.9.Ảnh vi thể tiêu bản đúc cắt tụy của chuột (vật kính 400)
A.Tụy chuột bình thường; B. Tụy chuột bịĐTĐ type 2 cho uống nước cất; C.
Tụy của chuột bịĐTĐ sau khi cho uống cao chiết lá chè dây; D. Tụy của chuột bị
Nhìn vào tiêu bản tụy hình 3.9 có thể thấy, ở chuột bình thường (A), mật độ tiểu
đảo tụy bình thường, hình thái bình thường. Các tế bào tiểu đảo tụy có hình thái và
kích thước bình thường, phân bố đồng đều không thấy dấu hiệu tổn thương. Chuột ĐTĐ type 2 uống nước cất (B), tụy bị tổn thương, mật độ tiểu đảo tụy giảm, tiểu đảo tụy biến dạng, thoái hoá và giảm về kích thước. So sánh với chuột ĐTĐ cho uống cao chiết chè dây và lá đắng, chúng tôi quan sát thấy mật độ và kích thước tiểu đảo tụy giảm hơn so với bình thường nhưng tiểu đảo tụy có sự phục hồi, không bị biến dạng teo lại (C, D).
3.4.1.2. Ảnh hưởng lên cấu trúc mô gan
Chúng tôi tiến hành đánh giá đại thể tiêu bản mô bệnh học của gan chuột ĐTĐ
type 2 ở các lô thí nghiệm sau khi cho uống 500 mg/kg cao chiết chè dây và lá đắng, kết quảđược trình bày ở hình 3.10.
Hình 3.10.Ảnh vi thể tiêu bản đúc cắt gan của chuột (vật kính 400)
A. Gan chuột bình thường; B. Gan chuột ĐTĐ type 2 uống nước cất; C. Gan chuột
Tế bào gan chuột bình thường (A) có hình khối đa diện bao bọc bởi màng tế bào, ở giữa là nhân. Nhânđược bao bọc bởi màng nhân, phân biệt rõ với phần tế bào chất bao quanh nhân. Trong nhân thường có 1-2 hạch nhân to tròn, bắt màu xanh. Tế bào chất, bắt màu eosin tương đối đều nhau nên toàn bộ các tế bào gan đều có màu hồng nhạt. Số lượng các tế bào gan có một nhân, chiếm số đông, ít khi gặp các tế bào gan có hai nhân. Các tế bào gan thuộc mỗi bè Remak xếp sít nhau. Chuột bị bệnh ĐTĐ type 2 cho uống nước cất (B), các tế bào gan có biểu hiện thoái hóa, tạo thành các đám hỗn độn với nhiều hình dạng khác nhau, các tế bào biến dạng méo mó rời rác, một số tế bào có nhân và tế bào chất bắt màu đậm hơn, dây tế bào gan bị biến dạng trầm trọng. Như vậy, việc tiêm thuốc STZ sau một thời gian đã làm tổn thương tế bào gan trầm trọng. Chuột bị bệnh ĐTĐ type 2 được điều trị bằng cao chiết chè dây và lá đắng (C, D), hình dạng và kích thước của tế bào và nhân tế bào không bị biến dạng, các tế bào gan vẫn thấy nhân nằm ở trung tâm tế bào, nhân tế bào bắt màu bình thường, dây tế bào gan ít bị biến dạng. Các tế bào gan của chuột ĐTĐ type 2 uống cao chiết ít bị tổn thương hơn so với tế bào gan ở lô chuột ĐTĐ type 2 đối chứng và khôi phục gần giống với tiêu bản gan chuột bình thường.
3.4.2. Nghiên cứu cao chiết phân đoạn lá chè dây
3.4.2.1. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các cao chiết phân đoạn chè
dây
Tách chiết các cao chiết phân đoạn của chè dây theo quy trình hình 2.3, chúng tôi sử dụng 2 kg bột khô lá chè dây, chiết bằng cồn 70°cho đến kiệt trong 2 tuần, thu đượccao cồn (CC), sau đó tách chiết phân đoạn ở các dung môi có độ phân cực khác nhau thu các cao phân đoạn n-hexan, EtOAc, n-BuOH. Kết quả tách chiết được trình
bày trên bảng 3.4.
Bảng 3.4. Phần trăm hàm lượng cao của các cao chiết phân đoạn lá chè dây
Bột khô CC CHe CEtOAc CBuOH
Khối lượng (g) 2.000 446 37 180 33
Trong các phân đoạn chè dây, CEtOAc chiếm tỷ lệ lớn nhất (40,36%), sau đó là CHe (8,30%) và ít nhất là CBuOH (7,4%). Chuột ĐTĐ type 2 cho uống các cao chiết phân đoạn chè dây với liều 500 mg/kg ở các thời điểm khác nhau là 0 giờ, 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày. Kết quả nồng độ đường huyết được thể hiện
trên bảng 3.5.
Bảng 3.5. Nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống cao chiết phân
đoạn lá chè dây
Lô (n = 10)
Nồng độ đường huyết (mmol/l)
Ngày 0 Ngày 3 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21
Đối chứng 22,69 ± 1,18 23,53 ± 0,87 22,74 ± 2,58 24,83 ± 2,79 30,49 ± 0,66 CHe 24,03 ± 1,22 24,80 ± 0,10 22,31± 2,61 21,55 ± 2,50 24,90 ± 1,37
CEtOAc 24,65 ± 1,03 22,92 ± 1,00 19,67 ± 1,25** 13,70 ± 0,85**# 9,07 ± 0,48**#
CBuOH 25,18 ± 1,26 23,91 ± 1,05 21,97 ± 1,25* 18,09 ± 0,70** 13,76 ± 0,55** #
Ghi chú: số chuột trong mỗi nghiệm thức 10,*p < 0,05, **p < 0,01 ( p so với
thời điểm trước khi điều trị của cùng nhóm); #p <0,01 (p so với lô chứng bệnh ở cùng
thời điểm khảo sát)
Trước thời điểm 7 ngày, chuột uống CHe, CEtOAc và CBuOH có nồng độ đường huyết có sự khác biệt nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Từ ngày thứ 7, CEtOAc thể hiện hoạt tính hạ đường huyết có ý nghĩa thống kê so với thời điểm trước khi điều trị trong cùng một nhóm và hoạt tính hạ đường huyết là tốt nhất tại ở ngày thứ 21 (p < 0,01). CBuOH có tác dụng hạ đường huyết bắt đầu ở ngày thứ 7 khi so với thời điểm trước khi điều trị trong cùng một nhóm (p < 0,05) và cao
nhất vào ngày thứ 21 (p < 0,01). Riêng đối với CHe không có tác dụng hạ đường huyết, chuộtuống cao chiết sau 21 ngày nồng độ đường huyết không hề thay đổi (p > 0,05).
cũng thể hiện hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất. Sau 21 ngày uống cao chiết, nồng độ đường huyết trung bình của chuột giảm còn 9,07 mmol/l, tiếp đến là CBuOH (13,76 mmol/l). Như vậy, có thể khẳng định phân đoạn CEtOAc có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất, tiếp theo là phân đoạn CBuOH.
3.4.2.2. Phân lập, xác định cấu trúc của các hợp chất từ cao phân đoạn chè dây có hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất
Chúng tôi tiến hành phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phân
đoạn có hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất để từ đó góp phần chứng minh tác dụng hạ đường huyết của chè dây. Qua thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được cao CEtOAc
cho thấy hoạt tính hạ đường huyết tốt hơn so với các cao còn lại. Tiến hành phân lập trên sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel pha thuận và pha đảo sử dụng các hệ dung
môi phù hợp, chúng tôi đã thu được một số hợp chất tinh sạch để tiến hành xác định cấu trúc.
* Phân lập chất
Phần CEtOAc (40 g) được tiến hành trên sắc ký cột silica gel với các hệ dung môi rửa giải là CHCl3-acetone-formic (10:3:1→10:5:1) và tách thành 6 phân đoạn,
kí hiệu PĐ1→PĐ6.
Từ phân đoạn 2 (PĐ2)các tinh thể màu vàng sáng xuất hiện. Sau mỗi lần kết
tinh đã thu được hợp chất tinh thể màu vàng sáng. Lọc kết tinh và rửa với cloroform và acetone thu được hợp chất CDE1 (100 mg).
Phân đoạn 4(PĐ4) được đưa lên cột silicagel pha đảo (RP-18) sử dụng acetone- H2O (1:6) làm dung môi rửa giảithu được chất rắn màu trắng. Lọc kết tinh và rửa với
cloroform và ethyl acetate thu được hợp chất CDE2 (170 mg).
Phân đoạn 5(PĐ5) được đưa lên cột silica gel và tách rửa bằng CHCl3-acetone
(8:1→0:1) để thuđược 2 phân đoạn, ký hiệu PĐ5.1→PĐ5.2. Tinh chế tiếp phân đoạn PĐ5.1 trên cột RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O (2,5:1) đã phân lập được hợp chất
CDE3 (10 mg).
Phân đoạn 6(PĐ6) được tinh chế trên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải là MeOH thu được hợp chất CDE4 (6 mg) và chất rắn màu vàng nhạt CDE5 (9 mg).
* Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập
a. Myricetin (CDE1)
Hợp chất CDE1 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, công thức phân tử của hợp chất đã được dựđoán là C15H10O8 dựa trên kết quả phổ ESI-MS đo ở cả kiểu ion hóa dương [M + H]+ với píc ion phân tử m/z 319 và ion hóa âm [M - H]- với píc ion phân tử m/z 317. Các phổ NMR của hợp chất CDE1 có dạng điển hình đặc trưng cho hợp chất flavonoid. Phổ13C –NMR (phụ lục 1) của hợp chất xuất hiện tín hiệu của 15 carbon bao gồm một tín hiệu của một nhóm carbonyl có độ dịch chuyển hóa học
ởδC 177,2; bốn tín hiệu của nhóm methine gồm 2 tín hiệu ởδC 99,2; 94,3 và hai tín hiệu
ở δC 108,5 ppm; mười tín hiệu của carbon bậc bốn. Phổ1H -NMR của hợp chất CDE1 cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của proton vòng thơm tách vạch doublet ở δH6,20 (1H; d; J=2,0 Hz) và δH 6,40 (1H; d; J= 2,0Hz) là các tín hiệu ghép cặp meta đặc
trưng tương ứng với H-6 và H-8 của vòng A flavonoid. Ngoài ra còn xuất hiện thêm 2 tín hiệu singlet của proton thơm ởcùng độ dịch chuyển hóa học δH 7,36 (2H; s) được gán cho hai vị trí H-2’ và H-6’ tương ứng của vòng B. Các số liệu phổ1H, 13C-NMR của hợp chất CDE1 (phụ lục 1) tương tựnhư số liệu phổ NMR của hợp chất myricetin đã được phân lập từ quảnho đen bởi Dajunvà cộng sự [62]. Các dữ liệu phổ1H và 13C- NMR cho tất cả các vị trí của proton và carbon của hợp chất (hình 3.13) đã được khẳng
định dựa trên cơ sở các mối tương tác trên phổ HSQC và HMBC. Các mối tương tác
chính trên phổ HMBC của hợp chất đã xác nhận vị trí của tất cả các nhóm hydroxyl ở
các vịtrí 5, 7, 3, 3’, 4’, 5’ như hình 3.11. Trên cơ sở các dữ liệu phổ 1D và 2D của NMR và có so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu [62], cấu trúc của
CDE1 đã được xác định là hợp chất myricetin.
b. Dihydromyricetin (CDE2)
Hợp chất CDE2 được phân lập dưới dạng bột màu trắng, công thức phân tử của hợp chất đã được dựđoán là C15H12O8 dựa trên kết quả phổ ESI-MS với píc ion phân tử [M + Na]+ thu được ở giá trị m/z 343,0; phổ13C-NMR của hợp chất xuất hiện tín hiệu của 15 carbon. Phổ UV của hợp chất cho thấy λmax ở 261, 319, và 348 nm gợi mởđây là một flavonoid. Dữ liệu phổ1H -NMR (phụ lục 2) của hợp chất CDE2 cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu của proton vòng thơm ở δH5,91 (1H; d; J=2,5 Hz); δH 5,95 (1H; d; J= 2,0 Hz) và δH 6,59 (2H; s), ngoài ra còn có hai tín