2
3.4.2. Nghiên cứu cao chiết phân đoạn lá chè dây
3.4.2.1. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các cao chiết phân đoạn chè
dây
Tách chiết các cao chiết phân đoạn của chè dây theo quy trình hình 2.3, chúng tôi sử dụng 2 kg bột khô lá chè dây, chiết bằng cồn 70°cho đến kiệt trong 2 tuần, thu đượccao cồn (CC), sau đó tách chiết phân đoạn ở các dung môi có độ phân cực khác nhau thu các cao phân đoạn n-hexan, EtOAc, n-BuOH. Kết quả tách chiết được trình
bày trên bảng 3.4.
Bảng 3.4. Phần trăm hàm lượng cao của các cao chiết phân đoạn lá chè dây
Bột khô CC CHe CEtOAc CBuOH
Khối lượng (g) 2.000 446 37 180 33
Trong các phân đoạn chè dây, CEtOAc chiếm tỷ lệ lớn nhất (40,36%), sau đó là CHe (8,30%) và ít nhất là CBuOH (7,4%). Chuột ĐTĐ type 2 cho uống các cao chiết phân đoạn chè dây với liều 500 mg/kg ở các thời điểm khác nhau là 0 giờ, 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày. Kết quả nồng độ đường huyết được thể hiện
trên bảng 3.5.
Bảng 3.5. Nồng độ đường huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống cao chiết phân
đoạn lá chè dây
Lô (n = 10)
Nồng độ đường huyết (mmol/l)
Ngày 0 Ngày 3 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21
Đối chứng 22,69 ± 1,18 23,53 ± 0,87 22,74 ± 2,58 24,83 ± 2,79 30,49 ± 0,66 CHe 24,03 ± 1,22 24,80 ± 0,10 22,31± 2,61 21,55 ± 2,50 24,90 ± 1,37
CEtOAc 24,65 ± 1,03 22,92 ± 1,00 19,67 ± 1,25** 13,70 ± 0,85**# 9,07 ± 0,48**#
CBuOH 25,18 ± 1,26 23,91 ± 1,05 21,97 ± 1,25* 18,09 ± 0,70** 13,76 ± 0,55** #
Ghi chú: số chuột trong mỗi nghiệm thức 10,*p < 0,05, **p < 0,01 ( p so với
thời điểm trước khi điều trị của cùng nhóm); #p <0,01 (p so với lô chứng bệnh ở cùng
thời điểm khảo sát)
Trước thời điểm 7 ngày, chuột uống CHe, CEtOAc và CBuOH có nồng độ đường huyết có sự khác biệt nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Từ ngày thứ 7, CEtOAc thể hiện hoạt tính hạ đường huyết có ý nghĩa thống kê so với thời điểm trước khi điều trị trong cùng một nhóm và hoạt tính hạ đường huyết là tốt nhất tại ở ngày thứ 21 (p < 0,01). CBuOH có tác dụng hạ đường huyết bắt đầu ở ngày thứ 7 khi so với thời điểm trước khi điều trị trong cùng một nhóm (p < 0,05) và cao
nhất vào ngày thứ 21 (p < 0,01). Riêng đối với CHe không có tác dụng hạ đường huyết, chuộtuống cao chiết sau 21 ngày nồng độ đường huyết không hề thay đổi (p > 0,05).
cũng thể hiện hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất. Sau 21 ngày uống cao chiết, nồng độ đường huyết trung bình của chuột giảm còn 9,07 mmol/l, tiếp đến là CBuOH (13,76 mmol/l). Như vậy, có thể khẳng định phân đoạn CEtOAc có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất, tiếp theo là phân đoạn CBuOH.
3.4.2.2. Phân lập, xác định cấu trúc của các hợp chất từ cao phân đoạn chè dây có hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất
Chúng tôi tiến hành phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phân
đoạn có hoạt tính hạ đường huyết tốt nhất để từ đó góp phần chứng minh tác dụng hạ đường huyết của chè dây. Qua thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được cao CEtOAc
cho thấy hoạt tính hạ đường huyết tốt hơn so với các cao còn lại. Tiến hành phân lập trên sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel pha thuận và pha đảo sử dụng các hệ dung
môi phù hợp, chúng tôi đã thu được một số hợp chất tinh sạch để tiến hành xác định cấu trúc.
* Phân lập chất
Phần CEtOAc (40 g) được tiến hành trên sắc ký cột silica gel với các hệ dung môi rửa giải là CHCl3-acetone-formic (10:3:1→10:5:1) và tách thành 6 phân đoạn,
kí hiệu PĐ1→PĐ6.
Từ phân đoạn 2 (PĐ2)các tinh thể màu vàng sáng xuất hiện. Sau mỗi lần kết
tinh đã thu được hợp chất tinh thể màu vàng sáng. Lọc kết tinh và rửa với cloroform và acetone thu được hợp chất CDE1 (100 mg).
Phân đoạn 4(PĐ4) được đưa lên cột silicagel pha đảo (RP-18) sử dụng acetone- H2O (1:6) làm dung môi rửa giảithu được chất rắn màu trắng. Lọc kết tinh và rửa với
cloroform và ethyl acetate thu được hợp chất CDE2 (170 mg).
Phân đoạn 5(PĐ5) được đưa lên cột silica gel và tách rửa bằng CHCl3-acetone
(8:1→0:1) để thuđược 2 phân đoạn, ký hiệu PĐ5.1→PĐ5.2. Tinh chế tiếp phân đoạn PĐ5.1 trên cột RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O (2,5:1) đã phân lập được hợp chất
CDE3 (10 mg).
Phân đoạn 6(PĐ6) được tinh chế trên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải là MeOH thu được hợp chất CDE4 (6 mg) và chất rắn màu vàng nhạt CDE5 (9 mg).
* Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập
a. Myricetin (CDE1)
Hợp chất CDE1 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, công thức phân tử của hợp chất đã được dựđoán là C15H10O8 dựa trên kết quả phổ ESI-MS đo ở cả kiểu ion hóa dương [M + H]+ với píc ion phân tử m/z 319 và ion hóa âm [M - H]- với píc ion phân tử m/z 317. Các phổ NMR của hợp chất CDE1 có dạng điển hình đặc trưng cho hợp chất flavonoid. Phổ13C –NMR (phụ lục 1) của hợp chất xuất hiện tín hiệu của 15 carbon bao gồm một tín hiệu của một nhóm carbonyl có độ dịch chuyển hóa học
ởδC 177,2; bốn tín hiệu của nhóm methine gồm 2 tín hiệu ởδC 99,2; 94,3 và hai tín hiệu
ở δC 108,5 ppm; mười tín hiệu của carbon bậc bốn. Phổ1H -NMR của hợp chất CDE1 cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của proton vòng thơm tách vạch doublet ở δH6,20 (1H; d; J=2,0 Hz) và δH 6,40 (1H; d; J= 2,0Hz) là các tín hiệu ghép cặp meta đặc
trưng tương ứng với H-6 và H-8 của vòng A flavonoid. Ngoài ra còn xuất hiện thêm 2 tín hiệu singlet của proton thơm ởcùng độ dịch chuyển hóa học δH 7,36 (2H; s) được gán cho hai vị trí H-2’ và H-6’ tương ứng của vòng B. Các số liệu phổ1H, 13C-NMR của hợp chất CDE1 (phụ lục 1) tương tựnhư số liệu phổ NMR của hợp chất myricetin đã được phân lập từ quảnho đen bởi Dajunvà cộng sự [62]. Các dữ liệu phổ1H và 13C- NMR cho tất cả các vị trí của proton và carbon của hợp chất (hình 3.13) đã được khẳng
định dựa trên cơ sở các mối tương tác trên phổ HSQC và HMBC. Các mối tương tác
chính trên phổ HMBC của hợp chất đã xác nhận vị trí của tất cả các nhóm hydroxyl ở
các vịtrí 5, 7, 3, 3’, 4’, 5’ như hình 3.11. Trên cơ sở các dữ liệu phổ 1D và 2D của NMR và có so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu [62], cấu trúc của
CDE1 đã được xác định là hợp chất myricetin.
b. Dihydromyricetin (CDE2)
Hợp chất CDE2 được phân lập dưới dạng bột màu trắng, công thức phân tử của hợp chất đã được dựđoán là C15H12O8 dựa trên kết quả phổ ESI-MS với píc ion phân tử [M + Na]+ thu được ở giá trị m/z 343,0; phổ13C-NMR của hợp chất xuất hiện tín hiệu của 15 carbon. Phổ UV của hợp chất cho thấy λmax ở 261, 319, và 348 nm gợi mởđây là một flavonoid. Dữ liệu phổ1H -NMR (phụ lục 2) của hợp chất CDE2 cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu của proton vòng thơm ở δH5,91 (1H; d; J=2,5 Hz); δH 5,95 (1H; d; J= 2,0 Hz) và δH 6,59 (2H; s), ngoài ra còn có hai tín hiệu duplet ở δH 4,52 (1H; d; J= 11,0 Hz) và δH 4,88 (1H; d; J=11,5 Hz) tương ứng với mỗi một proton trong cấu trúc đề xuất là 3-hydroxyflavanone hoặc 2, 3-dihydroflavonol trong bộ khung cấu trúc của hợp chất. Sự hiện diện của 2, 3- dihydroflavonol được khẳng định thêm bởi các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 13C -NMR (phụ lục 2). Dữ liệu phổ cho thấy sự xuất hiện tín hiệu của các nhóm oxymethine cộng hưởng ở δC 72,9 và 84,6 ppm. Ngoài ra, dữ liệu phổ1H-NMR của hợp chất cũng cho thấy sự hiện diện của hai proton thơm tách vạch doublet ởδH 5,91 (1H; d; J = 2,5 Hz) và 5,95 (1H; d; J = 2,5 Hz), ngoài ra còn thêm tín hiệu của hai
proton thơm singlet khác chập nhau ởđộ dịch chuyển là 6,59 ppm tương ứng với bộ
khung pentahydroxyl flavanonol.
Các vị trí của proton và carbon của hợp chất CDE2 đã được xác định dựa trên
cơ sở các tương tác trên phổ HSQC và HMBC và được đưa ra như trên hình 3.12. Các mối tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất đã xác nhận vị trí của tất cả năm nhóm hydroxyl ở các vị trí 5, 7, 3, 4’, 5’ như trong hình 3.12. Trên cơ sở các dữ
liệu phổ 1D và 2D của NMR và có so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu [54], cấu trúc của CDE2 đã được xác định rõ ràng là dihydromyricetin
(5, 7, 3, 4, 5′-pentahydroxyl flavanonol).
c. Phloretin (CDE3)
Hợp chất CDE3 phân lập được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử của hợp chất đã được dựđoán là C15H14O5 dựa trên kết quả phổ ESI-MS
đo ở cả kiểu ion hóa dương [M + H]+ với píc ion phân tử m/z 274,9 và ion hóa âm [M - H]- với píc ion phân tử m/z 272,8. Phổ1H-NMR của hợp chất CDE3 cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của các proton vòng thơm tách vạch doublet ở δH 6,72 (2H; d; J=8,5 Hz) tương ứng với H-3 và H-5 và δH 7,07 (2H; d; J= 8,5 Hz) tương ứng với H-2 và H-6. Ngoài ra còn xuất hiện thêm 2 tín hiệu singlet của proton thơm ở cùng độ dịch chuyển hóa học δH5,84 (2H; s) được gán cho hai vị trí H-3’ và H-5’ tương ứng bên cạnh đó còn có tín hiệu proton của hai nhóm methylene ởδH2,88 (2H; dd, 8,0; 7,5 Hz) và 3,33 (2H; dd, 8,0; 7,5 Hz). Phổ13C-NMR của hợp chất CDE3 xuất hiện tín hiệu của 15 carbon bao gồm một tín hiệu của một nhóm carbonyl có độ dịch chuyển hóa học ởδC 206,4 ppm; sáu tín hiệu của nhóm methine trùng nhau (overlap) từng cặp ở δC 95,7; 130,3; 116,1 ppm và hai tín hiệu methylene ở δC 31,4; 47,2 ppm; sáu tín hiệu của carbon bậc bốn. Các số liệu phổ1H, 13C-NMR của hợp chất CDE3 (bảng 3.6) tương tự như số liệu phổ NMR của hợp chất dihydrochalcone đã được phân lập năm 2015 bởi Qin và cộng sự [125].
Các tương tác trên phổ HMBC (phụ lục 3) giữa tín hiệu của proton có δH2,88 với C-1 (δC 134,0); C-2, C-6 (δC 130,3) và C-9 (δC 206,4) và giữa δH3,33 với C-7 (δC 31,4); C-1 (δC 134,0) và C-9 (δC206,4) đã khẳng định vị trí của nhóm carbonyl cũng như vị trí của hai nhóm methylene như trên hình 3.13. Trên cơ sở các dữ liệu phổ 1D và 2D của NMR và có so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu [125], cấu trúc của CDE3 đã được xác định rõ ràng là hợp chất phloretin (dihydrochalcone).
Bảng 3.6. Các số liệu phổ của phloretin C Phloretin (dihydrochalcone-CDE3) *δC δCa δHa (mult., J = Hz) Tương tác HMBC chính 1 132,6 134,0 2 128,9 130,3 7,07 (1H; d; 8,5 Hz) C-4 3 114,7 116,1 6,72 (1H; d; 8,5 Hz) C4 4 155,0 156,4 5 114,7 116,1 6,72 (1H; d; 8,5 Hz) C-4 6 128,9 130,3 7,07 (1H; d; 8,5 Hz) C-4 7 30,1 31,4 2,88 (2H; dd, 8,0; 7,5 Hz) C-1, C-2, C-6, C-9 8 45,9 47,2 3,33 (2H; dd, 8,0; 7,5 Hz) C-7, C-1, C-9 9 205,0 206,4 1’ 103,9 105,3 2’ 164,7 166,1 3’ 94,3 95,7 5,84 (1H, s) 4’ 164,4 165,8 5’ 94,3 95,7 5,84 (1H, s) 6’ 164,7 166,1
Hình 3.13. Cấu trúc của phloretin (CDE3)
d. Myricitrin (CDE4)
Hợp chất CDE4 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, công thức phân tử của hợp chất đã được dựđoán là C21H20O12 dựa trên kết quả phổ ESI-
MS đo ở kiểu ion hóa dương [M + H]+ với píc ion phân tử m/z 464,9 và ion hóa âm [M - H]- với píc ion phân tử m/z 462,9. Phổ13C -NMR của hợp chất xuất hiện tín hiệu của 21 carbon bao gồm một tín hiệu của một nhóm carbonyl có độ dịch chuyển hóa học ở δC 178,29; bốn tín hiệu của nhóm methine gồm 2 tín hiệu ở
δC 98,43; 93,31 và hai tín hiệu ở δC 108,22 ppm; một nhóm methyl ở δC 16,25 ppm; ba tín hiệu của nhóm methine oxygenate; mười tín hiệu của carbon bậc bốn. Phổ 1H -NMR của hợp chất CDE4 cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của proton
vòng thơm tách vạch doublet ở δH6,22 (1H; d; J=2,0 Hz) và δH 6,38 (1H; d; J=
2,0Hz) tương ứng với H-6 và H-8 của vòng A flavonoid. Ngoài ra còn xuất hiện thêm tín hiệu singlet của proton thơm có giá trị tích phân bằng 2 và có độ dịch chuyển hóa học ở δH 6,97 (2H; s) được gán cho hai vị trí H-2’ và H-6’ tương ứng của vòng B trong khung flavonoid. Các số liệu phổ1H, 13C-NMR của hợp chất CDE4 (bảng 3.7)
tương tựnhư số liệu phổ NMR của hợp chất CDE1 (myricetin) mà chúng tôi đã phân
lập được, ngoại trừ xuất hiện thêm các tín hiệu của một phân từ đường α-L-
rhamnopyranosyl. Trên phổ 1H-NMR (phụ lục 4) xuất hiện tín hiệu của proton anomeric của phân tử đường ở δH 5,34 (1H; d; 1,5 Hz; H-1”). Trên phổ HMBC xuất hiện tương tác giữa H-1” với C-3 (δC 134,93)/C-3” (δC 70,64), và giữa δH 0,99 (3H; d; 6,0 Hz; H-6”) với C-4” (δC 71,98). Khi so sánh các số liệu phổ của hợp chất CDE4 với dữ liệu phổ trong tài liệu tham khảo, chúng tôi nhận thấy có sự tương đồng rất cao với số liệu phổ của hợp chất myricitrin, một flavonol glycosideđã được phân lập từ lá cây Eugenia jambolana (cây trâm mốc) bởi Mahmoud và cộng sự [102]. Các vị
trí của proton và carbon trong cấu trúc của hợp chất CDE4 đã được khẳng định dựa
trên cơ sở các mối tương tác trên phổ HSQC và HMBC và được đưa ra trong bảng 3.7. Các mối tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất đã xác nhận vị trí của tất cả các nhóm hydroxyl ở các vị trí như trên hình 3.14. Trên cơ sở các dữ liệu phổ 1D và 2D của NMR và có so sánh với dữ kiện phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu [102], cấu trúc của CDE4 đã được xác định là hợp chất myricitrin.
Bảng 3.7. Các số liệu phổ của myricitrin Myricitrin (CDE4) C aδC δCb δHb(mult., J = Hz) Tương tác HMBC 2 157,47 158,07 3 134,20 134,93 4 177,77 178,29 5 161,30 161,81 6 98,60 98,43 6,22 (1H; d; 2,0) C-10, C-8 7 164,20 164,51 8 93,50 93,31 6,38 (1H; d; 2,0) C-10, C-6 9 156,40 157,14 10 104,01 104,50 1' 119,59 120,57 2' 107,88 108,22 6,97 (1H; s) C-2, C-4’, C-6’ 3' 145,76 145,47 4' 136,44 136,50 5' 145,76 145,47 6' 107,88 108,22 6,97 (1H; s) C-2, C-2’, C-4’ 1'' 101,93 102,23 5,34 (1H; d; 1,5) C-3, C-3” 2'' 70,00 70,49 4,24 (1H; dd; 1,5; 2,0) 3'' 70,37 70,64 3,81 (1H; dd; 3,5; 9,5) 4'' 71,26 71,98 3,6 (1H; m) 5'' 70,55 70,76 3,53 (1H; m) 6'' 17,50 16,25 0,99 (3H; d; 6,0 Hz) C-4”
Hình 3.14. Cấu trúc của myricitrin (CDE4)
e. Quercetin (CDE5)
Hợp chất CDE5 được phân lập dưới dạng bột màu vàng nhạt, công thức phân tử của hợp chất đã được dự đoán là C15H10O7dựa trên kết quả phổ ESI-MS ở cả hai
kiểu ion hóa dương và ion hóa âm với píc ion phân tử [M + H]+thu được ở giá trị m/z
302,9 và [M-H]-ở giá trị m/z 300,8. Phổ 13C -NMR của hợp chất CDE5 xuất hiện tín hiệu của 15 carbon, bao gồm một nhóm carbonyl có độ dịch chuyển hóa học ở δC
177,34; năm nhóm methine ở δC 99,27; 94,44; 116,03 116, 25 và
121,07 ppm, và chín carbon bậc bốn. Dữ liệu phổ MS và 13C-NMR gợi mở rằng đây là một flavonoid. Phổ 1H –NMR của hợp chất CDE5 cho thấy hai tín hiệu doublet của hai proton ghép cặp meta của proton vòng thơm tại δH6,20 (1H; d; J= 2,0 Hz) và 6,41 (1H; d; J= 2,0 Hz) tương ứng với C-6 và C-8 của vòng A. Ngoài ra, còn xuất hiện các tín hiệu doublet của proton thơm vòng B ở δH 7,75 (1H; d; J= 2,0 Hz); 6,91 (1H; d; J= 8,5 Hz) và δH 7,65 (1H; dd; J= 2,5; 2,5 Hz). Các dữ liệu phổ 1H, 13C - NMR (phụ lục 5) của hợp chất CDE5 tương tự như dữ liệu phổ NMR của hợp chất
quercetin, một flavonoid đã phân lập được từ loài Azolla microphylla [138]. Các vị trí của proton và cacbon của CDE5 đã được xác định dựa trên cơ sở các tương tác trên phổ HSQC và HMBC và được đưa ra như trên hình 3.15. Các mối tương tác
chính trên phổ HMBC (phụ lục 5) của hợp chất đã xác nhận vị trí của tất cả năm nhóm hydroxyl ở các vị trí 5, 7, 3, 3’, 4’ như trong hình 3.15. Trên cơ sở các dữ liệu phổ
1D và 2D của NMR và có so sánh với dữ kiện phổ của hợp chất tham khảo trong tài liệu [138], cấu trúc của CDE5 đã được khẳng định là quercetin.
Hình 3.15. Cấu trúc của quercetin (CDE5)