2
3.4.5. Hoạt động chống viêm và cải thiện tính kháng insulin của các hợp chất
phân lập từ chè dây và lá đắng
3.4.5.1. Kết quả ảnh hưởng của các hợp chất phân lập từchè dây và lá đắng lên khả năng sống sót của dòng tế bào Raw 264.7 và 3T3-L1
Kết quả thử hoạt tính gây độc lên dòng tế bào Raw 264.7 và 3T3-L1 của các
hợp chất phân lập được từ chè dây (myricetin; dihydromyricetin; phloretin; myricitrin và quercetin) và lá đắng (cynaroside và vernonioside E) được trình bày ở hình 3.19 và 3.20. Từ kết quả cho thấy, các hợp chất myricetin; dihydromyricetin; phloretin; myricitrin; quercetin; cynaroside và vernonioside E không có khả năng gây độc với tế bào Raw 264.7 và 3T3-L1 ở các nồng độ 5-40 µg/mL.
Hình 3.19.Đánh giá khảnăng gây độc của các hợp chất chè dây đối với Raw 264.7
(A) và 3T3-L1 (B)
Hình 3.20.Đánh giá khảnăng gây độc của các hợp chất lá đắng đối với Raw 264.7
3.4.5.2. Khả năng kháng viêm của các hợp chất phân lập từ chè dây và lá đắng LPS kích hoạt thụ thể trong các đại thực bào để tạo ra sự biểu hiện của các chất trung gian gây viêm như các cytokine tiền viêm (IL-1β, IL-6 và TNF-α) và các cytokine chống viêm (IL-10) [164]. Trong số 7 hợp chất phân lập được từ cây chè
dây và lá đắng hợp chất phloretin (chè dây) và vernonioside E (lá đắng) có khả năng ức chế hiệu quả đến quá trình sinh các cytokine tiền viêm TNF-α, IL-6, IL-8 so với các hợp chất myricetin; dihydromyricetin; quercetin; myricitrin và cynaroside. Tất cả các hợp chất phân lập không ức chế cytokine kháng viêm IL-10, kết quả thí nghiệm được trình bày ở hình 3.21 và 3.22.
Hình 3.21. Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập từ cây chè dây lên quá trình
sản xuất TNF-α (A), IL-6 (B), IL-8 (C) và IL-10 (D) trong tế bào Raw 264.7
Hình 3.22.Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập từ cây lá đắng lên quá trình
sản xuất TNF-α (A), IL-6 (B), IL-8 (C) và IL-10 (D) trong tế bào Raw 264.7
được kích thích bằng LPS
Tế bào đã được ủ với LPS sẽ làm tăng đáng kể hàm lượng cytokine (IL-6, IL-8, TNF-α và IL-10) khi so với tế bào không được xử lý bởi LPS. Điều trị các tế bào với nồng độ khác nhau (5-30 µg/mL) của phloretin và vernonioside E làm giảm đáng kể nồng độ IL-6, IL-8, TNF-α). Mức độ sản sinh TNF-α trong các tế bào sau
khi được điều trị bằng hợp chất phloretin và vernonioside E từ 250,63 và 310,49 pg/ml ở nồng độ 5 μg/mlgiảm xuống còn 72,89 và 119,56 pg/ml ở nồng độ 30 μg/ml.
Sau khi điều trị phloretin và vernonioside E, quá trình sinh IL-6 giảm xuống còn
211,53 và 219,86 pg/ml ở nồng độ 30 μg/mlvà cũng cho thấy tác dụng ức chế tế bào sản sinh IL-8 ở nồng độ 30 μg/ml (166,58 và 170,18 pg/ml). Ngược lại, phloretin và vernonioside E không ức chế cytokine kháng viêm IL-10. Trong khi đó, các hợp chất
myricetin; dihydromyricetin; quercetin; myricitrin và cynaroside cho thấy hiệu quả ức chế các cytokine yếu và không ức chế cytokine kháng viêm IL-10. Kết quả thực
nghiệm cho thấy phloretin và vernonioside E thể hiện rõ khả năng ức chế tế bào miễn dịch sản sinh TNF-α, IL-6 và IL-8 ở nồng độ 30µg/ml. Như vậy, có thể khẳng định
phloretin và vernonioside E là hoạt chất chính trong cao chiết cồn 700 của chè dây và lá đắng gây ức chế các cytokine tiền viêm TNF- α, IL-6 và IL-8. Tác dụng chống viêm của phloretin đã được nghiên cứu trên thế giới,
với liều 10 μM phloretin ức chế đáng kể nồng độ NO, PGE2, IL-6, TNF-α, iNOS và
COX-2 [53], trong khi đó vernonioside E là lần đầu tiên được báo cáo về hoạt tính chống viêm. Myricetin; quercetin; dihydromyricetin đã được công bố về hoạt tính chống viêm với khả năng làm giảm đáng kể nồng độ TNF-α và IL-6 [56], [94], [95].
Tuy nhiên kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự không đồng nhất với các kết quả nghiên cứu trước đó, vì vậy vai trò thật sự của các hợp chất này đối với ức chế các cytokine tiền viêm cần được làm rõ hơn trong các nghiên cứu sâu hơn.
3.4.5.3. Hiệu quả của phloretin và vernonioside E trong giảm tính kháng insulin
ở tế bào 3T3-L1 gây ra bởi TNF-α
Để gây kháng insulin, tế bào sẽ được bất hoạt insulin bởi TNF-α, từ đó để kiểm tra tác dụng của phloretin đối với độ nhạy insulin trong tế bào 3T3-L1. Quá trình kháng insulin trong các tế bào mô mỡđã được chỉ ra có mối liên hệ với đáp ứng viêm,
đặc biệt là với TNF-αđã ngăn chặn biểu hiện của nhiều protein trong tế bào mỡnhư
IR, IRS và GLUT4 dẫn tới giảm hấp thu glucose khi kích thích bằng insulin [51], [107]. Trong số hai hợp chất thử nghiệm phloretin và vernonioside E, chỉ có phloretin có khảnăng giảm tính kháng insulin trong tế bào mô mỡ 3T3-L1 thông qua khảnăng
hấp thụ lượng đường và kết quả được trình bày ở hình 3.23. Tế bào mô mỡ kháng
insulin được xử lý bằng phloretin (40 µg/ml) có khả năng hấp thụlượng đường tăng
(85,22 %) so với khi tế bào bị kháng insulin không được xử lý bằng phloretin (39,45 %). Do đó, phloretin đã cải thiện khảnăng hấp thu đường đáng kể trong các tế bào 3T3-L1 kháng insulin. Hợp chất phloretin lần đầu tiên được nghiên cứu về tác dụng giảm tính kháng insulin ở tế bào 3T3-L1 gây ra bởi TNF-α.
Hình 3.23. Hoạt động giảm tính kháng insulin của hợp chất phloretin và
vernonioside E trong tế bào 3T3-L1 được xử lý với TNF-α
3.4.5.4. Tác động của phloretin đối với biểu hiện p-IRS1 và Y20 trong con
đường tín hiệu hoạt động insulin
Kết quảtác động của phloretin đối với biểu hiện p-IRS1 và Y20 trong con đường tín hiệu hoạt động insulin được trình bày ở hình 3.24.
Hình 3.24. Ảnh hưởng của phloretin lên mức độ biểu hiện của hai protein IRS1
và pY20
Ghi chú: Các mức độ biểu hiện khác nhau của quá trình phosphoryl hóa thụ
thể p-IRS1 và phosphoryl hóa tyrosin pY20. IR: tế bào bị bất hoạt insulin; RM: nhóm
tế bào được ủ với thuốc rosiglitazone; ĐC: nhóm tế bào bình thường; Phloretin:
Từ kết quả hình 3.23 cho thấy cả hai protein (IRS-1 và Y20) được biểu hiện rõ ràng (sau khi ủ với phloretin và rosiglitazone-RM) hoặc không biểu hiện (không ủ với phloretin) ở tếbào kháng insulin (IR), điều này chỉ ra rằng có sựgián đoạn trong
con đường truyền tín hiệu insulin như báo cáo trước đây của Solomon và cộng sự
[141]. Sau khi điều trị bằng phloretin (200 µg/mL) và rosiglitazone (120 𝜇M) đã cho thấy làm tăng biểu hiện của cả hai protein Y20 và IRS-1 ở các tế bào kháng insulin. Biểu hiện của Y20 mạnh sau khi ủ với phloretin đã cung cấp cơ sở chứng minh cho khả năng tiềm tàng của phloretin trong tăng khả năng nhạy cảm của tế bào đối với tín hiệu insulin. Biểu hiện IRS-1 cũng được quan sát trong các tế bào bình thường và ở tế bào điều trị bằng phloretin và rosiglitazone. Trong khi đó, không có dải IRS-1 nào
được quan sát thấy trong các tế bào kháng insulin không được điều trị. Các tế bào được điều trị với rosiglitazone và phloretin đã cho thấy có thể khôi phục các biểu hiện của IRS-1. Như vậy, phloretin có hiệu quả trong con đường truyền tín hiệu insulin thông qua phục hồi biểu hiện của hai protein Y20 và IRS-1, điều này sẽ dẫn đến sự dịch chuyển của GLUT-4 để tăng sự hấp thu glucose vào trong tế bào. Các tác dụng hạ đường huyết của phloretin thông qua khôi phục biểu hiện hai protein IRS-1 và Y20
của tế bào chưa từng được được báo cáo trước đây.