2.5.1. Phương pháp luận
Nghiên cứu có tính kế thừa, sử dụng số liệu đã có và nghiên cứu thực nghiệm bổ sung trên các hiện trường nghiên cứu đã được xây dựng từ các chương trình nghiên cứu trước đây. Áp dụng các phương pháp nghiên cứu đang được áp dụng phổ biến cho nghiên cứu chọn giống, lâm sinh, sinh thái học, khoa học gỗ để thực hiện các nghiên cứu thực nghiệm và kết hợp với phương pháp phân tích thống kê toán học để thu được kết quả nghiên cứu mang tính toàn diện và đảm bảo độ tin cậy đáp ứng được mục tiêu đề ra.
2.5.2. Phương pháp nghiên cứu cụ thể
2.5.2.1. Phương pháp nghiên cứu sinh trưởng và chất lượng thân cây
a) Thiết kế khảo nghiệm dòng vô tính
Các khảo nghiệm giống được xây dựng trong khuôn khổ của đề tài:
“Nghiên cứu chọn tạo giống keo tam bội sinh trưởng nhanh phục vụ trồng rừng
gỗ lớn” tại 3 vùng sinh (Đông Bắc Bộ, Bắc Trung Bộ và Đông Nam Bộ). Do hạn
chế về vật liệu giống, số lượng các dòng đưa vào khảo nghiệm có phần khác nhau giữa các địa điểm nghiên cứu. Mỗi địa điểm nghiên cứu bố trí đồng thời 2 khảo nghiệm dòng vô tính với dung lượng mẫu khác nhau (10 cây và 49 cây),
sau đây được gọi là khảo nghiệm ô 10 cây và khảo nghiệm ô 49 cây. Khảo
nghiệm ô 10 cây được bố trí tất cả các dòng keo tam bội có được tại thời điểm xây dựng khảo nghiệm. Khảo nghiệm ô 49 cây có số dòng hạn chế hơn, hầu hết các dòng đều đã được xác định là có triển vọng thông qua các nghiên
cứu thăm dò trước đây. Các khảo nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ với 4 lần lặp cho khảo nghiệm ô 10 cây và 3 lần lặp cho khảo nghiệm ô 49 cây. Số lượng dòng (nghiệm thức) cụ thể trong mỗi khảo nghiệm theo địa điểm nghiên cứu được thể hiện ở Bảng 2.4.
Bảng 2.4: Số nghiệm thức của mỗi khảo nghiệm tại 3 điểm nghiên cứu
Số lượng Số lượng Tổng số Số lần lặp
Địa điểm dòng keo tam dòng đối nghiệm thức lại
bội chứng
Khảo nghiệm ô 10 cây
Yên Thế (Bắc Giang) 8 2 10 4
Cam Lộ (Quảng Trị) 11 3 14 4
Xuân Lộc (Đồng Nai) 12 3 15 4
Khảo nghiệm ô 49 cây
Yên Thế (Bắc Giang) 4 2 6 3
Cam Lộ (Quảng Trị) 5 2 7 3
Xuân Lộc (Đồng Nai) 6 2 8 3
Biện pháp kỹ thuật áp dụng trong các khảo nghiệm:
- Cây giống: Sử dụng cây hom theo tiêu chuẩn TCVN 11570-2:2016 [21]
- Kích thước hố trồng: 40 × 40 × 40 cm.
- Phân bón: bón lót đồng loạt 200 g super lân 16,5% P2O5/cây. - Mật độ trồng 1.667 cây/ha (3 × 2 m).
- Chăm sóc: Sau khi trồng 7 ngày tiến hành trồng dặm lại những cây bị chết. Kiểm soát cỏ dại, xới đất vun gốc được thực hiện 2 lần/năm, trong 3 năm đầu.
b) Phương pháp đo đếm các chỉ tiêu sinh trưởng
Các chỉ tiêu sinh trưởng gồm: tỷ lệ sống, đường kính ở vị trí 1,3 m (D1.3)
và chiều cao vút ngọn (Hvn), được đo cho toàn bộ số cây trong các khảo nghiệm.
Tỷ lệ sống (TLS) được xác định bằng cách đếm số cây sống và được tính theo công thức TLS = số cây hiện tại/số cây trồng ban đầu x 100, đơn vị tính %;
Đường kính ngang ngực (D1.3) được đo bằng thước đo vanh đã được quy đổi ra
cao điện tử với độ chính xác từ 0,1 - 0,5m.
c) Phương pháp đo tăng trưởng hàng tháng (Zd)
+ Chọn cây mẫu: Mỗi ô trong khảo nghiệm ô 49 cây, chọn 6 cây phân đều cho 3 cấp kính (nhỏ, trung bình, lớn)
+ Cách đo: Sử dụng vòng nhựa (không co giãn) có khả năng nới ra tự
động để đeo cho cây ở vị trí 1,3 m (Hình 2.1). Tăng trưởng D1.3 được tính thông
qua tăng trưởng chu vi. Tăng trưởng chu vi hàng tháng được xác định là khoảng cách từ điểm đánh dấu gần nhất đến nút “đóng mở”. Dụng cụ đo là thước mềm có khả năng uốn theo thân cây, có độ chính xác 1 mm (Hình 2.1a).
+ Thời điểm thu số liệu: Số liệu được thu vào ngày 30 hàng tháng, trong thời gian từ 3/2017 – 12/2019 (20 – 40 tháng tuổi).
(a)
Hình 2.1: Vòng đo tăng trưởng
chu vi hàng tháng (b)
d) Phương pháp xác định chỉ số diện tích lá (leaf area index – LAI)
Chỉ số diện tích lá (LAI) được xác định dựa theo phương pháp được phát minh bởi các chuyên gia của CSIRO (Úc) và đã được áp dụng trong dự án ACIAR FST/2006/087, giai đoạn 2008 – 2012 (Beadle và cộng sự, 2013) [39] và nghiên cứu của Vũ Đình Hưởng và cộng sự (2016) [75]. Các bước tiến hành như sau:
+ Chụp ảnh tán lá: Ảnh được chụp cùng thời điểm khi đo tăng trưởng
đường kính D1.3 hàng tháng. Trong mỗi ô của khảo nghiệm ô 49 cây, chụp 10
ảnh tán lá (song song với mặt đất) ở các vị trí cố định, sắp xếp trên 2 đường song song cách đường chéo của ô thí nghiệm 1,0 m về 2 phía (khoảng cách giữa
2 hàng ảnh là 2,0 m, khoảng cách giữa 2 vị trí chụp liên tiếp là 2,0 m) (Hình 2.2).
+ Phân tích ảnh: Phân tích ảnh kỹ thuật số bằng phần mềm Fiji với trình cắm chuyên dụng ImageAnalysisDSMblueFilter.ijm được tạo ra bởi các chuyên gia của CSIRO (Úc).
+ Tính chỉ số LAI dựa vào tỷ lệ ánh sáng xuyên qua tán lá có được từ phân tích các ảnh chụp ở trên.
Hình 2.2: Vị trí chụp ảnh tán lá để phân tích LAI
e) Phương pháp đánh giá chất lượng thân cây
Các chỉ tiêu liên quan đến chất lượng thân cây được đánh giá gồm: độ thẳng thân (Đtt), độ nhỏ cành (Đnc), chỉ số phát triển ngọn (Ptn), chỉ số sức khỏe (Sk).
- Đtt được đánh giá theo tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8761-1:2017 [28].
-Đnc, Ptn, Sk được đánh giá bằng hình thức chấm điểm dựa theo phương
+ Đối với Đnc:
5 điểm: Dgc < 1/5 đường kính thân cây ở vị trí phân cành. 4 điểm: Dgc 1/5 - < 1/4 đường kính thân cây ở vị trí phân cành. 3 điểm: Dgc 1/4 - < 1/3 đường kính thân cây ở vị trí phân cành. 2 điểm: Dgc 1/3 - < 1/2 đường kính thân cây ở vị trí phân cành.
1 điểm: Dgc ≤ 1/2 đường kính thân cây ở vị trí phân cành.
+ Đối với Ptn:
Điểm 1: Mất ngọn, cụt ngọn.
Điểm 2: Có nhiều ngọn, tán hình elip phát triển theo chiều rộng. Điểm 3: Có ngọn chính phát triển, nhưng tán lệch hay tán dạng hình tròn Điểm 4: Có ngọn chính phát triển, tán hình tháp tù.
Điểm 5: Có một ngọn chính phát triển, tán dạng hình tháp nhọn cân đối. + Đối với sức khoẻ (Sk):
5 điểm: Cây phát triển tốt, ngọn chính phát triển mạnh, cây khoẻ mạnh, lá xanh thẫm và tán lá cân đối;
4 điểm: Cây phát triển khá, ngọn chính phát triển khá, lá xanh và tán lá có sức sống;
3 điểm: Cây phát triển trung bình, duy trì ngọn chính và tán lá phát triển bình thường;
2 điểm: Cây phát triển kém, ngọn chính thiếu sức sống, lá xanh nhạt và tán lá thưa;
1 điểm: Cây phát triển rất kém, mất ngọn chính, lá vàng úa và tán lá rất thưa.
2.5.2.2. Phương pháp nghiên cứu tính chất vật lý và cơ lý gỗ
a) Thu mẫu gỗ
- Chọn cây mẫu: Tại mỗi địa điểm, mỗi dòng được xác định để nghiên cứu tính chất gỗ, tiến hành chọn 5 cây có sinh trưởng trung bình theo dòng, phân bố tương đối đều trên toàn khảo nghiệm. Mỗi cây mẫu đều được đánh dấu
4 hướng (Đông – Tây – Nam – Bắc) trước khi chặt hạ.
- Cắt mẫu gỗ: Mẫu gỗ cho các chỉ tiêu về khối lượng riêng, tỷ lệ gỗ lõi và sợi gỗ được thu theo từng thớt nguyên vẹn, có độ dày 5 cm ở các vị trí 1,3 m; 3
m; 4,5 m, 6,0 m và 7,5 m (Hình 2.3). Các thớt gỗ được ghi số hiệu và bảo quản
cẩn thận, ngay sau khi cắt ra khỏi cây, mẫu được bỏ vào túi nylon kín và để trong bóng mát. Mẫu sau khi cắt được chuyển ngay về phòng thí nghiệm.
Mẫu gỗ cho các chỉ tiêu về tổng độ co rút, độ bền uốn tĩnh và mô-đun đàn hồi là khúc gỗ từ vị trí 0,3 – 1,3 m.
Hình 2.3: Sơ đồ vị trí thu mẫu gỗ theo trục dọc thân cây
b) Phương pháp phân tích mẫu gỗ
* Phương pháp xác định khối lượng riêng cơ bản của gỗ
Khối lượng riêng cơ bản của gỗ được xác định cùng lúc cho toàn bộ thớt gỗ khi, theo phương pháp nước chiếm chỗ của TAPPI (2006) [123]. Mẫu từ hiện trường về được bóc vỏ và ngâm chìm trong nước cho tới khi bão hòa – khối lượng không đổi (12 giờ). Sau đó, tiến hành cân mẫu ở dưới nước để xác định thể tích của mẫu gỗ theo định luật Ác-si-mét (Hình 2.4).
Mẫu sau khi cân, được sấy khô ở điều kiện nhiệt độ
105oC tới khối lượng không
đổi (thời gian sấy khoảng 72 giờ). Cách kiểm tra mẫu sấy, trước khi cân chính thức, tiến hành cân thử 3 mẫu có kích thước khác nhau (to nhất, trung bình và nhỏ nhất) 2 lần, cách nhau 2 giờ đồng hồ. Nếu chênh lệch khối lượng mẫu
Hình 2.4: Cân mẫu gỗ trong nước để xác định thể tích
giữa 2 lần cân < 2 g thì mẫu đã đạt yêu cầu, ngược lại thì tiếp tục sấy và tiến hành kiểm tra lại bằng cách làm tương tự cho đến khi mẫu đạt chuẩn mới tiến hành cân đồng loạt.
Khối lượng riêng gỗ được tính toán dựa vào khối lượng gỗ khô ngay sau khi sấy với thể tích thớt gỗ được xác định ở trên.
* Phương pháp xác định tỷ lệ gỗ lõi Sử dụng chung thớt gỗ với nội dung xác định khối lượng riêng (sau khi ngâm nước). Ranh giới giữa gỗ giác và gỗ lõi trên mỗi thớ t gỗ được xác định dựa vào sự khác biệt về màu
sắc (Hình 2.5). Đường kính thớt gỗ
và đường kính gỗ lõi được đo theo hướng Đông – Tây, Nam – Bắc. Diện tích đĩa và diện tích gỗ lõi được tính theo công thức hình e-líp (Pillai và
cộng sự, 2013) [105]
Hình 2.5: Thớt gỗ để xác định tỷ lệ gỗ lõi
* Phương pháp xác định chiều dài sợi gỗ
Chiều dài sợi gỗ được xác định theo theo tiêu chuẩn ASTM D5103 – 07 (2012) [37]. Các bước thực hiện được mô phỏng ở Hình 2.6.
(a)
(b) (c) (d) (e) (f)
Hình 2.6: Các bước tiến hành xác định chiều dài sợi gỗ
(a) mẫu gỗ theo chiều xuyên tâm; (b) dăm mẫu gỗ trước khi ngâm vào dung dịch HNO3; (c) ngâm mẫu trong dung dịch HNO3; (d) tiêu bản sợi gỗ; (e) quan sát sợi gỗ trên
kính hiển vi điện tử; (f) kích thước sợi gỗ được đo trên kính hiển vi.
* Phương pháp xác định tổng độ co rút tuyến tính của gỗ + Theo phương xuyên tâm và tiếp tuyến
Tổng độ co rút tuyến tính của gỗ theo phương xuyên tâm và tiếp tuyến được thực hiện theo tiêu chuẩn TCVN 8048-13:2009 [24].
+ Theo thể tích
Tổng độ co rút tuyến tính của gỗ theo thể tích xác định theo TCVN 8048-14:2009 [25].
* Xác định độ bền uốn tĩnh (MOR) của gỗ
Độ bền uốn tính của gỗ được xác định theo tiêu chuẩn TCVN 8048- 3:2009 [26]. Xác định độ ẩm sau khi thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8048-1 (ISO 3130) [23].
* Xác định mô-đun đàn hồi (MOE) của gỗ
Mô-đun đàn hồi của gỗ được xác định theo tiêu chuẩn TCVN 8048- 4:2009 [27]. Xác định độ ẩm sau khi thực hiện như đối với độ bền uốn tĩnh.
2.5.2.3. Phương pháp nghiên cứu tính bất thụ của keo tam bội
Bảng 2.5: Chỉ tiêu sinh học sinh sản của keo tam bội được nghiên cứu
Các chỉ tiêu được đánh giá liên quan đến khả năng bất thụ Các chỉ tiêu đánh giá cho cây hậu thế của các dòng Ký Địa điểm Đánh giá tổng thể cả Bất dục tính đực Bất dục tính cái Hình thái/sinh
TT Dòng cây Các chỉ tiêu trưởng
hiệu theo dõi
Mức độ Mức độ đậu về hình thái Tỷ lệ hoa Tỷ lệ nảy mầm Tỷ lệ đậu quả Tỷ lệ s ống của Vườn Ngoài Độ bội thể
ra hoa quả (điểm) hoa đực/bông của hạt phấn và kết hạt hạt và cây hậu ươm rừng
(điểm) (%) (%) (%) thế (%)
A Các dòng keo tam bội
1 X01 MA XL + + + + + + - - - - 2 X11 MA XL và ĐP + + + + + + - - - - 3 X41 Aa XL và ĐP + + + + + + - - - - 4 X42 Aa XL và ĐP + + + + + + - - - - 5 X101 AM XL và ĐP + + + + + + - - - - 6 X102 AM XL và ĐP + + + + + + - - - - 7 X201 AM XL và ĐP + + + + + + + + + + 8 X202 AM ĐP + + + + + + - - - - 9 X204 AM XL và ĐP + + + + + + - - - - 10 X205 AM XL và ĐP + + + + + + - - - - 11 X1100 MA* XL + + + - - - - - - - 12 X1200 MA* XL + + + - - - - - - - 13 X1201 MA* XL + + + - - - - - - -
B Keo lai, Keo lá tràm nhị b ội (đối chứng)
1 BV73 - XL + + + - - - - - - -
2 BV33 - ĐP + + + + + + + + - -
Các chỉ tiêu nghiên cứu về tính bất thụ cua keo tam bội tại 2 địa điểm nghiên cứu được thể hiện ở Bảng 2.5. Phương pháp nghiên cứu cụ thể cho mỗi chỉ tiêu được thực hiện như sau:
a) Nghiên cứu về đặc điểm hình thái hoa
Nghiên cứu đặc điểm hình thái hoa được thực hiện theo phương pháp của
Sedgley và cộng sự (1992) [114]. Cách thực hiện như sau: (1) Chọn 3 cây trong
số những cây đã được chọn để quan sát mức độ ra hoa ở trên để thu mẫu hoa; (2) Thu 20 bông đại diện/cây ở khoảng giữa của tán cây, theo 4 hướng chính (5 bông/hướng). Hoa thu được bảo quản cẩn thận trong ống falcon có nắp kín và được để trong thùng đá nhằm tránh cho hoa bị héo; (3) Quan sát, đo đếm hoa được thực hiện trong phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu bao gồm: màu sắc, chiều dài bông, tổng số hoa/bông, số hoa đực/bông. Màu sắc hoa được quan sát bằng mắt thường. Chiều dài bông được đo bằng thước kẻ, có độ chính xác là 1 mm.
Hoa đực, hoa cái được quan sát bằng kính lúp.
Keo lá tràm Keo lai
Hình 2.7: Hoa của Keo lá tràm (màu vàng) và keo lai (màu vàng kem)
b) Đánh giá về mức độ ra hoa, đậu quả
Mức độ ra hoa, đậu quả được đánh giá bằng hình thức cho điểm, dựa theo
phương pháp của Sedgley và cộng sự (1992) [114]. Theo đó, mỗi dòng chọn 10
cây đại diện (có sinh trưởng ở mức trung bình trở lên, tán cây phát triển cân đối, không bị sâu bệnh) để quan sát. Thời gian theo dõi từ tháng 8 đến tháng
4 năm sau (mùa hoa quả chính). Mức độ ra hoa, quả được đánh giá bằng hình thức cho điểm, với 4 mức như sau:
(0) không ra hoa, quả
(1) < 1/3 tán cây có hoa, quả (2) 1/3 – 2/3 tán cây có hoa, quả (3) > 2/3 tán cây có hoa, quả.
c) Đánh giá chất lượng hạt
Chất lượng hạt ở đây được đánh giá dựa vào đặc điểm hình thái, kích thước (dài, rộng) và trọng lượng. Cách tiến hành như sau: (1) Quả sau khi được thu về được để trong phòng 2 – 3 ngày cho chín đều, sau đó tiến hành bóc tách để thống kê số hạt/quả, phân loại hạt (chắc, lép). Mỗi hạt được đặt cho 1 mã số để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo; (2) Đo kích thước (dài, rộng) bằng thước kẹp điện tử có độ chính xác tới 0,01 mm; (3) Cân trọng lượng hạt bằng cân điện tử có độ chính xác tới 0,01 g
d) Xác định tỷ lệ nảy mầm của hạt phấn
Tỷ lệ nảy mầm hạt phấn được xác định trên môi trường agar theo các bước sau: (1) Thu hoa vào đầu buổi sáng, sau đó được làm khô bằng silica gel đến khi hạt phấn có thể bung ra (khoảng 3 giờ đồng hồ), theo dõi thường xuyên không để phấn khô quá ảnh hưởng tới tỷ lệ nảy mầm; (2) Hạt phấn được sàng lên môi trường agar: 1% agar + 20% đường sucrose + 0,01% axít boric (Lê Đình Khả, 2006) [12] và để ở điều kiện nhiệt độ phòng; (3) Sau 4 giờ tiến hành quan sát theo định kỳ 1 giờ/lần bằng kính hiển vi quang học cho đến khi không còn hạt phấn nảy mầm nữa thì dừng lại. Hạt phấn được cho là nảy mầm khi chiều dài ống phấn lớn hơn đường kính hạt phấn. Mỗi dòng quan sát 3 cây, mỗi cây quan sát 3 mẫu “đĩa”, mỗi đĩa quan sát 300 hạt phấn.
e) Xác định tỷ lệ đậu quả
Tỷ lệ đậu quả của được xác định dựa vào phương pháp của Sedgley và cộng sự (1992) [115] như sau: (1) Trên những cây đã được chọn để thu mẫu
hoa ở trên, tiến hành treo nhãn và đánh dấu cành để theo dõi tỷ lệ đậu quả. Cành hoa được chọn ở khoảng giữa của tán cây, phân bố tương đối đều theo 4