cao
Các mẫu mối được thu thập từ tổ mối trên cây gỗ và mía đã mục, trên thân cây ở các địa điểm khác nhau của các huyện Thanh Chương, Nghi Lộc thuộc địa bàn thành phố Vinh và trường Đại học Bách Khoa Hà nội (Bảng 2.1). So sánh đặc điểm hình thái của mối, đặc điểm của tổ mối với tài liệu định danh cho thấy các mẫu mối thu nhận đều cĩ đặc điểm của lồi mối gỗ khơ Coptotermes.
Ở Việt nam, qua điều tra nhiều năm người ta thấy loại phổ biến nhất thường phá hoại các cơng trình 95-97% (Nguyễn Quốc Huy, 2017) là giống mối
Coptotermes thuộc lồi Rhinotermitidae [92]. Tổ mối trong gỗ thường thấy ở lồi
mối khơ, tổ nằm gọn trong thanh gỗ khơng cĩ liên hệ gì với đất, tổ cĩ kết cấu đơn giản, quần thể khơng lớn thường cĩ các lỗ thơng từ hang này đến hang khác hoặc thơng ra ngồi
Hình 3.1.Hình ảnh mẫu mối thu thập
Khả năng phân giải cellulose của chủng được đánh giá thơng qua tỷ lệ đường kính vịng thủy phân với đường kính khuẩn lạc D/d [93][94][95].
Kết quả chi tiết đặc điểm khuẩn lạc và khả năng tạo vịng thủy phân của các chủng phân lập từ ruột mối được trình bày ở phụ lục 1 (Bảng PL1-5). Số lượng chủng phân lập từ các mẫu mối và khả năng tạo vịng thủy phân trên mơi trường nhuơm congo 1% của các chủng phân lập đươc tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1Thống kê kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột mối
Ký hiệu mẫu mối
01 02
03 04 05 06 07 08 Tổng
Kết quả bảng 3.1 cho thấy số lượng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu tương đối lớn 108 chủng vi khuẩn. Tuy nhiên tỷ lệ các chủng cĩ tỷ lệ đường kính vịng thủy phân/đường kính khuẩn lạc (D/d) cao lại khơng nhiều. Số lượng chủng cĩ D/d ≥ 5 là 11/108 chiếm 10,2%, số lượng chủng cĩ D/d trong khoảng 2-5 là 31 chủng chiếm 28,7%. Cịn lại phần lớn các chủng cĩ tỷ lệ D/d ≤ 2 chiếm tỷ lệ cao nhất 61,1%.
Các chủng vi khuẩn phân lập từ các mơi trường làm giàu cĩ thành phần khác nhau cũng khơng giống nhau. Các mẫu mối 1, 2, 3, 4 được làm giàu cùng lúc trên 5 loại mơi trường M1, M2, M3, M4 và M5 được tổng kết trên bảng 3.2.
Bảng 3.2Số lượng các chủng vi khuẩn phân lập được trên các mơi trường làm giàu
STT Mơitrường làm giàu 1 M1 2 M2 3 M3 4 M4 5 M5 Tổng
Kết quả bảng 3.2, cho thấy các mơi trường làm giàu M1 và M3 là mơi trường khống nghèo dinh dưỡng cho số lượng chủng loại lớn hơn so với các mơi trường cịn lại. Mơi trường M4 và M5 là mơi trường M3 bổ sung thêm glucose và M2 là mơi trường cĩ pepton nhưng lại cho số lượng chủng loại vi khuẩn phân lập được thấp hơn, điều này cĩ thể được giải thích là do mơi trường giàu dinh dưỡng kích thích các loại vi khuẩn sinh trưởng nhanh phát triển làm lấn át các chủng vi khuẩn sinh trưởng chậm hơn dẫn đến mặc dù số lượng khuẩn lạc lớn hơn nhưng số chủng loại lại ít hơn.
Các chủng cĩ khả năng sinh cellulase cao là những chủng cĩ tỷ lệ D/d > 5 [71]. Trong nghiên cứu này để đảm bảo lựa chọn được các chủng cĩ hoạt độ cellulase cao vừa đảm bảo tính đa dạng, các chủng cĩ tỷ lệ D/d từ 4,8 trở lên, cĩ hình thái khuẩn lạc khác nhau từ các mẫu mối, trên mơi trường làm giàu và cơ chất làm giàu khác nhau được lựa chọn và tổng hợp ở bảng 3.3. Cĩ thể thấy chủng cĩ tỷ lệ D/d cao nhất đạt giá trị 10 là chủng G4.
Kết quả bảng 3.3 khi so sánh với nghiên cứu của Pratima Gupta và cộng sự (2011) cho thấy cĩ sự tương đương, trong nghiên cứu của Gupta đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn cĩ khả năng phân giải cellulose từ ruột mối trên mơi trường khống, nghèo dinh dưỡng trong thời gian 7 ngày, các chủng phân lập cĩ tỷ lệ đường kính vịng thủy phân/ đường kính khuẩn lạc D/d dao động từ 4,32 đến 5,49 và tỷ lệ D/d lớn nhất là 9 [94]. Trong một nghiên cứu khác của tác giả NYI Merkar Saptarini khi tiến hành phân lập trên mối và nguồn cacbon chủ yếu là lõi ngơ. Kết quả phân lập được 3 chủng cĩ tỷ lệ D/d trong khoảng 5,02 – 5,24 [71]. So với các nghiên cứu đã cơng bố thì kết quả của chúng tơi là khả quan khi cĩ 2 chủng với tỷ lệ D/d trong khoảng từ 8-10.
Bảng 3.3Các chủng cĩ tỷ lệ (D/d) cao được chọn lựa
STT Cơ chất sử dụng cho quá trình làm giàu 1 CMC 2 3 4 5 6 7 8 Giấy lọc 9 Cơ chất tự nhiên
10 cám gạo, đậu tương
11
Các chủng vi khuẩn cĩ tỷ lệ đường kính vịng thủy phân cao tiếp tục được nuơi trên mơi trường lỏng LB với cơ chất CMC và bã mía 0,5%, ở nhiệt độ 370C, lắc 150 vịng/phút. Kết quả xác định hoạt độ enzym tương ứng (Bảng 3.4 và Hình 3.2).
Bảng 3.4Hoạt độ cellulase và xylanase của các chủng vi khuẩn lựa chọn TT Ký hiệu chủng 1 TM1-7.1 2 MP3 3 MP1 4 CG2 5 G4 6 CG4 7 T2-11 8 CM2-4 9 D1-8 10 D1-12 11 CG4-1-2 ND- Khơng xác định
Hình 3.2Hoạt độ enzym các chủng vi khuẩn từ ruột mối
Các chủng lựa chọn cĩ hoạt độ CMCase dao động trong khoảng từ 0,124 U/ml đến 0,752 U/mL. So sánh với hoạt độ của các vi khuẩn phân lập từ ruột mối theo cơng bố của Sharma và cộng sự cho thấy các vi khuẩn phân lập được từ ruột mối ở Nepal thuộc các lồi Bacillus, Cellulomonas và Enterobacter cũng cĩ hoạt độ CMCase từ 0,07 U/ml – 0,2 U/ml [96]. Các vi khuẩn phân lập được từ mối bậc cao theo Sreeremya và cộng sự cũng đã xác định được là các chủng Pseudomonas
fluorescens, Bacillus subtilis, E.coli và Serratia marscens cĩ hoạt độ từ CMCase
0,05 U/ml -0,9 U/ml [34].
Các chủng phân lập được ngồi hoạt tính CMCase cịn cĩ hoạt tính các hoạt tính khác như FPU, β-glucosidase, acevilase và xylanase. Trong các thí nghiệm này do chưa tối ưu điều kiện sinh tổng hợp enzym nên hoạt độ các enzym cịn tương đối thấp. Chủng cĩ hoạt độ CMCase cao nhất là G4 sau đĩ là MP1 và T2-11 tương ứng với 3 chủng cho tỷ lệ D/d cao nhất (Bảng 3.3). Đặc biệt chủng MP1 cĩ hoạt độ FPU và xylanase cao nhất trong các chủng, hứa hẹn tiềm năng khai thác để thủy phân lignocellulase.
3.2. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hĩa của các chủng lựa chọn 3.2.1. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hĩa
Đặc điểm hình thái và đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn lựa chọn được tổng kết ở bảng 3.5.
Bảng 3.5.Đặc điểm hình thái, sinh lý của 11 chủng vi khuẩn tuyển chọn STT Ký hiệu chủng 1 CM2-4 2 CG2 3 CG4 4 CG4-1- 2 5 D1-8 6 D1-12
T2-11 8 TM1- 7-1 9 G4 10 MP1 11 MP3
Kết quả nhuộm Gram, khả năng tạo bào tử và quan sát hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc cho thấy cĩ 7/11 ( 63,6%) chủng lựa chọn là CM2-4, CG4-1-2, G4, D1-8, D1-12, T2-11, G4 cĩ nhiều đặc điểm giống chi Bacillus như trực khuẩn gram dương, tạo bào tử và sinh catalase. Kết quả này tương đồng với các kết quả đã cơng bố là Bacillus chiếm tỉ lệ cao trong hệ vi sinh vật ruột mối [25][6][9]. Các chủng
Bacillus thường cĩ khả năng sinh tổng hợp cellulase cao và do vậy là điều dễ hiểu
khi chiếm tỷ lệ lớn trong các chủng lựa chọn.
Sử dụng 2 loại kit là Kit 20E và Kit 50 CHB để xác định các đặc tính sinh hĩa của các chủng lựa chọn. Kết quả thể hiện ở bảng phụ lục 1 bảng 6 và bảng 7
Sau khi đã cĩ bảng đặc tính của các chủng vi khuẩn chúng tơi tiếp tục phân tích trình tự 16S rDNA để định tên các vi khuẩn đã lựa chọn.
3.2.2. Định tên các vi khuẩn ruột mối
Kết hợp phương pháp định tên bằng 16S RNA và các đăc điểm sinh lý sinh hĩa vi khuẩn, dựa trên tham khảo tài liệu định tên theo Bergey [97]. Chúng tơi đã cĩ kết quả định tên các chủng vi khuẩn như trên bảng 3.8
Bảng 3.6Kết quả định tên các chủng vi khuẩn lựa chọn từ ruột mối
STT Ký hiệu chủng 1 CM2-4 2 CG2 3 CG4 4 CG4-1-2 5 T2-11 6 TM1-7-1 7 G4 8 MP1 9 MP3
Cĩ thể thấy các chủng vi khuẩn phân lập được tương đối đa dạng, hầu hết các lồi phân lập được trong nghiên cứu cũng đã từng được cơng bố trước đây, như cơng bố của Sreeremya và cộng sự cũng đã phân lập được các vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, E.colivà Serratia marscens từ ruột mối
bậc cao ở Ấn Độ [34]. Cơng bố khác của Wenzel và cộng sự cho biết đã áp dụng điều kiện nuơi cấy hiếu khí và phân lập được 119 chủng vi khuẩn cellulolytic từ ruột mối Zootermopsis angusticollis, các chủng này thuộc các nhĩm Cellulomonas,
Microbacterium, Bacillus, Rhizobium, Pseudomonas [9]. Kết quả phân lập vi khuẩn
từ ruột mối ở Nepan cũng cho thấy các chủng phân lập được xác định là Bacillus,
Tại Việt Nam theo cơng bố của Nguyễn Thị Thảo và cộng sự cho thấy số lồi vi khuẩn cĩ khả năng sinh cellulase chủ yếu trong ruột mối thuộc ngành Firmicutes (15/24 lồi), phần lớn thuộc lớp Clostridia, bộ Clostridiales. Lồi chiếm ưu thế nhất cĩ khả năng sinh cellulase là Pseudomonas fluorescens thuộc bộ Pseudomonadaceae. Trong 18 lồi sinh hemicellulase, lồi chiếm ưu thế nhất là
Clostridium thermocellum thuộc ngành Firmicutes, sau đĩ 3 lồi thuộc ngành
Bacterroidetes. Các vi khuẩn cĩ khả năng sinh cellulase, hemicellulase được ước đốn là C.thermocellum, Ruminococus flavefacien và Bacilus subtilis [39].
Bacillus subtilis là chủng thuộc lồi đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới
và ở Việt Nam, được ứng dụng nhiều trong thực tế. B. subtilis đã từng được phân lập từ ruột mối và các nguồn khác, như phân lập từ ruột tằm cơng bố của A.Anand và cộng sự (2021) [98], phân lập từ ruột mối theo cơng bố như của tác giả Tarayre C và cộng sự (2014) khi nghiên cứu trên lồi mối Reticulitermes santonesis [99]. Kết quả tương tự, các tác giả khác cũng đã phân lập được vi khuẩn thuộc giống
Bacillus khi tiến hành phân lập trên các loại mối khác nhau như Zootermopis angusticollis, Reticultermes Hesperus, Coptotermes curvignathus, Reticulitermes speratus [75]. Với những chủng thuộc giống Bacillus phân lập được hầu như đều
sinh Endoglucanase, số ít cĩ thêm hoạt lực β-glucosidase và hoạt lực tổng FP- cellulase.
Các nghiên cứu phân lập về Klebsiella cịn rất hạn chế. Năm 2010, khi Cho M-J cùng cộng sự (2010) tiến hành nghiên cứu trên đối tượng là lồi mối
Reticulitermes speratus đã phân lập được chủng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase
thuộc lồi Klebsiella sp, ơng cũng chứng minh được chúng cĩ khả năng sinh tổng hợp ba loại enzym: cellobiohydrolase, β-glucosidase và Endoglucanase [3]. Trong một nghiên cứu khác của Mattéotti C và cộng sự (2011) chủng vi khuẩn phân lập được thuộc lồi Klebsiella sp cĩ hoạt tính β-glucosidase [100] .
Trabulsiella guamensis, là một thành viên của chi Gammaproteobacteria
trong họ Enterobacteriaceae. Năm 2007, nghiên cứu của Chou và cộng sự, đã phân lập được chủng Trabulsiella odontotermitis [10]. Tuy nhiên, chưa cĩ nghiên cứu nào cơng bố về khả năng phân giải cellulose của chủng này.
Trong nghiên cứu của tác giả Mark Silby và cộng sự (2011) đã phân lập được chủng vi khuẩn thuộc lồi Pseudomonas sp từ ruột mối Micocerotermes diversus [101]. Pseudomonas cũng là chi cĩ khả năng sinh endoglucanase và FP-cellulase trong một nghiên cứu gần đây của tác giả Bholay A.D, và cộng sự (2014) khi nghiên cứu phân lập vi khuẩn từ ruột mối [15]. Khi tiến hành phân lập vi khuẩn từ ruột mối
hoạt tính cellulase cao nhất ở pH 7.0 và 30ºC [43]. Đây cũng là lồi cĩ mặt chiếm tỷ lệ nhiều nhất trong mối Coptotermes gestroi ở Việt Nam của Đỗ Thị Huyền và cộng sự [17].
Cellulosimicrobium đã từng được phân lập từ ruột mối được cơng bố bởi tác
giả Agapia và cộng sự (2002) và trong các cơng bố khác như của Yon 2007, Liu 2015 và Huang 2012 [102][103][12]. Tuy nhiên các nghiên cứu về hệ enzym thủy phân cellulose cũng như các nghiên cứu về thu nhận, ứng dụng cellulase từ lồi vi khuẩn này cịn rất hạn chế.
Từ kết quả các nghiên cứu trên kết hợp với các tài liệu đã được cơng bố chúng tơi nhận thấy Bacillus và Cellulosimicrobium là nhĩm cĩ mặt với xác suất cao trong vi khuẩn ruột mối, 2 nhĩm này cũng đã được chứng minh cĩ hoạt tính cellulase cao và ngồi hoạt tính CMCase cịn cĩ thêm các các hoạt tính khác cĩ khả năng phân giải cellulose hiệu quả, tiếp đến 2 nhĩm này thuộc nhĩm vi khuẩn Gram ( nên ít mang các yếu tố gây bệnh hơn so với các chủng Gram (-). Chính vì những lý do đĩ chúng tơi đã lựa chọn 2 chủng là Bacillus subtilis G4 và
Cellulosimicrobium sp MP1 để nghiên cứu thu nhận cellulase và đánh giá tiềm năng
phân giải cellulase của chủng.
3.3. Nghiên cứu thu nhận cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis G43.3.1. Nghiên cứu lựa chọn mơi trƣờng và điều kiện thích hợp cho quá 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn mơi trƣờng và điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase
3.3.1.1. Lựa chọn mơi trường sinh tổng hợp cellulase
Bacillus subtilis G4 được nuơi cấy trên các mơi trường LB, M1 M2 và M6
trong thời gian 48 giờ ở 37°C, tốc độ lắc 100 vịng/phút, sau đĩ xác đinh hoạt tính CMCase trên các mơi trường tương ứng, kết quả thu được như trên Hình 3.3
H oạ t đ ộ CM Ca se (U /m l) 2 1.5 1 0.5 0 LB M1 M2 M6
Mơi trường sinh tổng hợp
Hình 3.3Hoạt độ CMCase của chủng B. subtlis G4 trên các mơi trường nuơi cấy
Kết quả hình 3.3 cho thấy, với các mơi trường nuơi cấy khác nhau thì khả năng sinh CMCase của G4 cũng khác nhau, trong đĩ M6 là mơi trường thích hợp
nhất cho quá trình sinh CMCase. M6 là mơi trường cĩ các thành phần cám gạo, bột đậu tương và casein, đây là mơi trường mà các thành phần cĩ nguồn gốc tự nhiên, cĩ thể thấy chủng G4 phát triển tốt hơn so với các mơi trường mà các thành phần là hĩa chất tinh khiết. Mơi trường M6 cũng là mơi trường được Li và cộng sự đã sử dụng nuơi cấy để thu nhận endo-cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis YJ1[75].
Chúng tơi lựa chọn M6 làm mơi trường sinh tổng hợp cellulase cho các nghiên cứu tiếp theo. Trên mơi trường M6 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối đã được cơng bố bởi Sreena và cộng sự. cĩ hoạt tính từ 0,4 U/mg – 1,2 U/mg trên mơi trường chưa tối ưu hĩa [5].
3.3.1.2 Ảnh hưởng của các thơng số lên men đến hoạt độ CMCase
Để thu nhận được enzym cĩ hoạt độ cao trên mơi trường M6, các yếu tố như nhiệt độ, tốc độ lắc, thời gian lên men và pH mơi trường đã được nghiên cứu. Kết quả thu được như hình 3.4
Hình 3.4.Ảnh hưởng của các thơng số nuơi cấy đến hoạt độ CMCase của B. subtilis G4. Tỷ lệ giống (A), tốc độ lắc (B), Nhiệt độ
(C) và pH mơi trường (D).
Từ các kết quả trên cho thấy các yếu tố tỷ lệ cấp giống, tốc độ lắc, nhiệt độ mơi trường và pH mơi trường cĩ ảnh hưởng rất lớn tới hoạt độ enzym, bằng phương pháp nghiên cứu đơn yếu tố kết quả cho thấy hoạt độ enzym thu được đạt cao nhất khi tỷ lệ cấp giống 1%, tốc độ lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ mơi trường nuơi cấy 37ºC, pH mơi trương 7.
pH = 7,0 cũng là pH phù hợp nhất cho quá trình sinh enzym của Bacillus sp S3B8 phân lập từ ruột mối [104]. Tuy nhiên, cơng bố của Sreeremya và cộng sự cũng cho biết, các chủng Bacillus phân lập từ ruột mối hoạt độ cellulase lớn nhất ở 40ºC, pH từ 9 -10 [34]
Quá trình sinh tổng hợp enzym tồn tại khoảng thời gian cĩ hoạt độ enzym cao nhất, qua thời điểm này hoạt tính enzym sẽ giảm do các yếu tố sinh lý tác động. Vì vậy thời gian thu nhận enzym là yếu tố quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp