Ảnh hưởng của bột đậu tương đã được khảo sát với kết quả thu được như sau:
Bảng 3.14Ảnh hưởng của nồng độ bột đậu tương tới khả năng sinh enzym của chủng Nồngđộ bột tƣơng (%) 0 0,5 1,0 1,5 2.0
Kết quả trên cho thấy với nồng độ 1.5% bột đậu tương trong mơi trường thu được CMCase cĩ hoạt tính cao nhất.
Quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men và ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy đã tìm được điều kiện phù hợp cho quá trình sinh cellulase từ chủng vi khuẩn MP1.
Vi khuẩn MP1 được nuơi trên mơi trường cĩ nồng độ tinh bột 1%, casein 1%, bột đậu tương 1,5 % với các điều kiện nhiệt độ 37ºC, thời gian nuơi cấy 72h, tỷ lệ giống 5%, tốc độ lắc 100 vịng/phút, pH mơi trường 7,5 là mơi trường phù hợp cho quá trình sinh cellulase. Hoạt độ CMCase đạt cao nhất là 3,25 U/ml. Đây là mơi trường được lựa chọn để thu nhận enzym cho các nghiên cứu khảo sát khả năng thủy phân của enzym từ MP1.
3.4.2. Xác định đặc tính cellulase tạo thành bởi Cellulosimicrobium sp. MP1
3.4.2.1. Thu nhận chế phẩm cellulase bằng kết tủa bởi ethanol
Dịch enzym thơ thu sau ly tâm được kết tủa sử dụng cồn tuyệt đối với các nồng độ cuối khác nhau 20%, 40%, 60% và 80%.
Bảng 3.15Thơng số enzym từ MP1 sau kết tủa bằng ethanol
Nồng độ V dich dung (mL) mơi E thơ 100 20% 10 40% 10 60% 10 80% 10
Kết quả Bảng 3.15 cho thấy khi nồng độ ethanol càng cao, lượng protein kết tủa thu được càng nhiều và đạt cao nhất ở nồng độ cồn 80% với hiệu suất thu hồi theo protein đạt 31,43%. Tuy hiệu suất thu hồi enzym đạt cao nhất tại nồng độ cồn 80% nhưng độ tinh sạch chỉ đạt 4,00%. Độ tinh sạch enzym cao nhất tại 60% cồn đạt 5,56. Do đĩ, chế phẩm enzym ở nồng độ cồn 60% v/v được lựa chọn cho nghiên cứu đặc tính chế phẩm.
3.4.2.2. Xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Cellulosimicrobium sp. MP1 Nhiệt độ và pH tối ƣu
Protein enzym sau khi kết tủa tại nồng độ cồn 60% v/v được hịa tan trong các dung dịch đệm cĩ pH khác nhau.
Hình 3.17.Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme CMCase từ MP1
Kết quả cho thấy khoảng pH hoạt động hiệu quả của enzym kết tủa từ dịch lên men của chủng Cellulosimicrobium sp. MP1 là tương đối rộng từ 5-10. Trong đĩ ở pH 6 hoạt độ CMCase đo được là lớn nhất, đạt 0,23 ± 0,003 U/ml. Kết quả này phù hợp với một số báo cáo kết luận pH hoạt động tối ưu của cellulase từ
Cellulosimicrobium là 5-6 [117][118].
So với nghiên cứu tách cellulases kiềm tính từ Bacillus subtilis của Deepmoni Deka (trong đĩ, hoạt độ CMCase đạt tối ưu ở pH 9, nhưng hoạt tính chỉ đạt 70% ở các pH 8 và 10), enzym cellulase từ Cellulosimicrobium sp. MP1 cĩ khoảng pH hoạt động tối ưu rộng hơn, tại pH 10 hoạt độ vẫn đạt gần 90% so với pH tối ưu. Đây là một đặc điểm đáng chú ý cĩ tiềm năng ứng dụng của enzym CMCase thu từ chủng Cellulosimicrobium sp. MP1.
Protein enzym sau khi kết tủa được hịa tan trong đệm Na-phosphate pH 6,0 pha lỗng thích hợp và thực hiện phản ứng với cơ chất CMC (hịa tan trong đệm tương ứng) ở các nhiệt độ khác nhau.
Hình 3.18.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase từ MP1
Kết quả cho thấy hoạt độ CMCase cao nhất ở 600C, cao hơn nhiệt độ 500C trong cơng bố của Jian-Min Song và cơng sự khi nghiên cứu cellulases từ
C.cellulans [118]. Ở nhiệt độ 700C, hoạt độ enzym CMCase giảm 20% so với hoạt độ xác định ở nhiệt độ tối ưu.
Xác định độ bền nhiệt và bền pH
Kết quả Hình 3.19 cho thấy ở pH axit bằng 4, hoạt tính enzym giảm mạnh cịn 20% sau 20h. Tuy nhiên, từ khoảng pH 5, độ bền hoạt độ enzyme duy trì tương đối ổn định từ 70-80%.
Hình 3.19.Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ MP1
Trong nghiên cứu của Jian-Min Song và cộng sự, hoạt tính CMCase thu từ
C.cellulans giảm mạnh cịn 18% sau 6 giờ ở pH axit 3 và 4. Kết luận này tương đối
phù hợp với kết quả thí nghiệm thể hiện trong Hình 3.19. Tuy nhiên, ở các giá trị pH khác, hoạt tính cellulase của chủng MP1 duy trì ổn định tốt hơn so với nghiên cứu của Jian-Min Song. Cụ thể, hoạt tính tương đối của CMCase từ C. cellulans cịn lại lần lượt là 34,39% và 26,26% sau 6giờ ở pH 5 và pH 7, trong khi enzym CMCase từ MP1 duy trì hoạt tính đến 70% sau 20 giờ ở khoảng pH khá rộng từ 5-10.
Kết quả Hình 3.20 cho thấy ở nhiệt độ càng cao, sự suy giảm hoạt tính diễn ra càng nhanh và càng sớm ngay ở những giờ đầu tiên. Sau 2 giờ, hoạt tính CMCase ở nhiệt độ 40°C và 50°C giảm khơng đáng kể cịn hơn 90%. Hoạt tính CMCase tương đối cịn 70% ở nhiệt độ 60°C và giảm mạnh cịn 30% ở nhiệt độ 70°C sau 2 giờ. Khi kéo dài đến 4giờ, hoạt độ của enzym ủ ở các nhiệt độ 40, 50, 60°C giảm cịn 40-43% trong khi hoạt độ chỉ cịn 10% ở 70°C. Trong nghiên cứu về độ bền nhiệt của cellulases thu từ C.cellulans của Jian-Min Song và cộng sự, ở nhiệt độ 45°C, cellulase cịn giữ được 55,68% hoạt tính sau 6h cịn ở nhiệt độ 600C hoạt độ enzym giảm mạnh đến 75-90% . Đối với chủng MP1, hoạt độ CMCase cũng giảm tương tự đến 60% sau 4h ở 600C.
Hình 3.20.Độ bền nhiệt chế phẩm cellulase từ MP1
3.5. So sánh giữa B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1
Bảng 3.16.So sánh giữa enzyme từ B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1
Thơng số Enzym thơ Hoạt độ CMCase tối ưu Hoạt độ FPU Hoạt độ xylanase Chê phẩm cellulase pH tối ưu Bền pH
Nhiệt độ tối ưu (°C) Bền nhiệt (°C)
Mặc dù enzym thơ từ B. subtilis G4 cĩ hoạt độ CMCase cao hơn từ
điều đĩ dẫn tới hiệu suất thủy phân thấp khi sử dụng enzym từ G4 để thủy phân rơm và bã mía (Hình 3.14). Hơn nữa khi quan sát quá trình thủy phân giấy lọc cĩ thể thấy enzym từ MP1 thủy phân giấy lọc tốt hơn enzym từ G4 (Hình 3.21).
Hình 3.21. Thử nghiệm phân giải giấy lọc của MP1 và G4
Chế phẩm cellulase thu được từ Cellulosimicrobium sp. MP1 cĩ khoảng pH hoạt động rộng hơn và cĩ khả năng hoạt động tốt ở pH kiềm, rất phù hợp để thủy phân nguyên liệu cellulose.
Thử nghiệm với các cơ chất cho thấy chủng MP1 thuộc chi
Cellulosimicrobium phân lập được cĩ khả năng phân hủy các cơ chất bã mía, rơm,
giấy lọc (hình 3.21), cho thấy chủng MP1 phân lập được cĩ khả năng tiết ra hỗn hợp các enzym phá hủy được cấu trúc phức tạp của cơ chất. Hỗn hợp này (enzymatic bulk) cĩ thể bao gồm endoglucanases, cellobiohydrolases và β-glucosidases để thủy phân thành tế bào của nguyên liệu, cũng như cĩ chứa endoxylanases và β- xylosidases đĩng vai trị thủy phân các thành phần hemicellulose.
Vi những lý do trên chủng Cellulosimicrobium sp. MP1 sẽ được tiếp tục nghiên cứu ở mức độ AND.
3.5. Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hĩa enzym thủy phân cellulosecủa chủng C. cellulans MP1 của chủng C. cellulans MP1
3.5.1. Trình tự gen và một số đặc điểm khái quát của chủng C. cellulans MP1
Vì phân tích trình tự gen đã và đang giúp mở ra con đường tìm hiểu nhiều hơn về các enzym liên quan đến sự phân giải sinh khối thực vật, trình tự gen của chủng C. cellulans MP1 đã được phân tích với kỹ thuật Illumina Miseq. Thư viện gen thu được đã cho ra tất cả là 443 986 169 nucleotit và được tổng hợp để tạo thành 4 487 842 bản đọc với vị trí cụ thể và với độ lặp là 92,2 lần. Trình tự gen của chủng MP1 (4 580 223 bp với hàm lượng GC 73.9%) được sắp xếp lại thành một nhiễm sắc thể hình trịn với 23 contig và khơng phát hiện thấy cĩ plasmid (hình 3.22). Tồn bộ hệ gen của chủng được dự đốn cĩ 4117 gen bao gồm 4 046 trình tự
mã hĩa protein (CDS), 67 trình tự quy định rRNA, 3 trình tự quy định tRNA, 1 trình tự quy định tmRNA (hình 3.22).
Hình 3.22Sơ đồ genom của C.cellulans MP1
3.5.2. Các cụm gen và chức năng gen của chủng MP1
Trong tồn bộ các trình tự mã hĩa protein thì 79.5% (3216 trong 4046) được phân vào 21 trong 25 nhĩm chức năng COG. Trong đĩ, các nhĩm chiếm nhiều nhất là: phiên mã (K: 365 trình tự), vận chuyển và chuyển hĩa carbonhydrate (G: 307), vận chuyển và chuyển hĩa amino acid (E: 224), sản sinh và chuyển hĩa năng lượng (C: 199), và vận chuyển và chuyển hĩa (P: 180). Ngược lại, nhĩm liên quan đến việc điều hịa chu trình, phân chia tế bào và nhiễm sắc thể (D: 33), cấu tạo và điều khiên sợi nhiễm sắc (B: 2) và di chuyển tế bào (N: 1) là các nhĩm chiếm ít nhất.
Việc phân tích chức năng của các gen cung cấp cái nhìn sâu hơn về các chức năng của chủng MP1. Tổng số 3165 gen được phân vào 43 lớp con bao gồm 13 lớp con thuộc lớp cấu tạo tế bào (CC), 10 lớp con thuộc lớp liên quan đến phân tử chức năng (MF), và 20 lớp con liên quan đến các quá trình sinh học (BP). Cụ thể, lớp CC chiếm nhiều gen nhất (1638 gen, 45,3%) tiếp theo là lớp BP (1424 gen, 39,4%) và MF ( 553 gen, 15,3%). Các con đường chiếm nhiều nhất là tế bào (GO:0005623; 508 gen), thành phần tế bào (GO:0044464; 379 gen) và cấu tạo thành tế bào (GO:0016020; 340gen). Trong lớp BP 3 nhĩm chiếm ưu thế là quá trình chuyển hĩa (GO:0008152; 378 gen), quá trình trong tế bào (GO:0009987; 379) gen và phát triển (GO:0040007; 281 gen). Trong các lớp nhỏ thuộc vào lớp MF, các gen thuộc nhĩm cĩ hoạt tính xúc tác (GO:0003824) và bám (GO:0005488) chiếm 311 và 176 gen.
Hình 3.23Phân loại chức năng gen
3.5.3. So sánh COG tồn bộ hệ gen và các enzym liên quan đến chuyển hĩa carbonhydrate
Sự tiến hĩa của vi khuẩn là nhờ sự tiến hĩa thẳng và bắt nguồn từ 1 gen tổ tiên duy nhất, từ đĩ tạo thành các gen tiến hĩa thẳng trong các lồi khác nhau, để cĩ thể hiệu rõ hơn về chức năng, cấu tạo cũng như sự biến đổi của các gen thì cần phải cĩ sự so sánh các nhĩm COG ở các chủng khác nhau. Các nhĩm COG của chủng
C. cellulans MP1 được so sánh với của 4 chủng khác gồm J36, LMG16121,
và JKA48. Chủng C. cellulans MP1 cĩ 3405 gen thuộc vào các nhĩm COG và 794 gen độc lập. Các chủng J36 và ZKA48 cĩ lần lượt 3604 và 3605 gen thuộc các nhĩm COG, trong khi chủng LMG16121 cĩ ít gen COG nhất (hình 3.25). Trong đĩ thì số gen đơn lẻ lớn nhất thuộc về chủng MP1. Biểu đồ Venn Edward 6 chiều cho thấy rằng cĩ 2539 gen COG được tìm thấy trong cả 4 chủng thuộc chi C. cellulans. Trong số các COG riêng biệt của mỗi chủng thì chủng MP1 cĩ 20 và là số lượng lớn nhất trong 4 chủng. Để kiểm chứng kết quả này, cơng cụ xây dựng cây phân lồi REALPHY đã được sử dụng. Với lựa chọn cây cĩ khả năng xảy ra cao nhất (maximum likelihood), cây phân lồi được xây dựng cho thấy 2 chủng MP1 và LMG16121 tạo thành một nhánh riêng, cho thấy một mối quan hệ tiến hĩa mật thiết (hình 3.24).
Hình 3.24. Cây phân lồi chủng C.cellulans MP1
Sử dụng trang web dbCAN2, các gen được dự đốn tổng hợp các CAZy của chủng C. cellulans MP1 được sàng lọc để tìm ra các gen liên quan đến việc phân hủy cellulose và hemicellulose. Sau khi loại bỏ các trình tự khơng liên quan, 195 vùng gen được dự đốn là CAZy được tìm thấy, chúng chiếm 4,8% trong tổng số 3216 vùng của chủng này. Các enzym glycoside hydrolase (GH) phụ trách việc phân hủy phần lớn sinh khối thực vật (cellulose và hemicellulose) được dự đốn là họ enzym nhiều nhất và chiếm đến 99 enzym. Tiếp theo là 39 enzym glycosyl transferase (GT), 37 đơn vị bám vào carbohydrate (CBM), 11 enzym carbohydrate esterase (CE), 6 enzym với các hoạt tính phụ trợ (AA) và 3 enzym polysaccharide lyases (PL) được phát hiện
Hình 3.25So sánh genom của MP1 với các chủng C.cellulans
Hệ gen của 4 chủng C. cellulans MP1, J36, LMG16121, ZKA48 đã được so sánh. Về cơ bản, số lượng vùng thuộc nhĩm CAZy của chủng MP1 lớn hơn rất nhiều so với các chủng khác (hình 3.25). Các vùng CAZy được tìm thấy trong C.
cellulans MP1 cĩ độ tương đồng cao với chủng C. cellulans J36. Mặc dù 2 chủng
MP1 và LMG16121 cĩ quan hệ gần gũi, nhưng MP1 sở hữu nhiều hơn chủng LMG16121 56 vùng CAZy. Ngồi chủng LMG16121 các số vùng thuộc vào các họ GT, CBM và AA của các chủng cịn lại gần như là bằng nhau, cho thấy sự tác động đồng thời của các gen vùng này trong quá trình phân hủy sinh khối thực vật
3.5.4. Khai thác các enzym thủy phân sinh khối thực vật từ nguồn gen của chủng C. cellulans MP1.
Phân tích các gen CAZy đã tìm ra 30 gen liên quan đến cellulose trong hệ gen của C. cellulans MP1. Các họ enzym lớn, liên quan đến việc thủy phân cellulose bao gồm GH6, GH9, GH48, GH10, GH16, GH1, GH3, GH13, và GH64. Việc định danh gen đã phát hiện 5 endoglucanase (2 thuộc họ GH6 và 3 thuộc họ GH9), 3 exoglucanases (GH6,GH10, GH48) và lichenase (GH16) tồn tại trong hệ gen của chủng MP1 (bảng 3.17). Trong 8 gen tổng hợp endo và exo glucanase thì 5 gen (Orf_454, Orf_1616, Orf_3244, Orf_1607, Orf_1611) cĩ gắn thêm vùng CBM2 (một vùng cĩ thể bám vào phần tinh thể của các cơ chất cellulose, chitin, xylan). CBM2 là vùng CBM cĩ mặt nhiều nhất trong hệ gen của MP1. Hệ gen của MP1 cịn cĩ các gen quy định 3 enzym thuộc GH1 và GH6, enzym thuộc GH3 cĩ hoạt tính β- glucosidase được xem là gĩp phần quan trọng trong quá trình thủy phân cellulose và 3 enzym khác thuộc họ GH13 cĩ hoạt tính α-glucosidase. Ngồi ra cịn cĩ 2 họ enzym polysaccharide lyase liên quan đến việc phân giải pectin: PL4 (Orf_102) và PL1 (Orf_1326) (Bảng 3.17).
Bảng 3.17Danh mục các cellulase và hemicellulase dự đốnbiểu hiện trên hệ gen của C. cellulans MP1
Phân loại enzym Cellulose- related Hemicellulose- related
Xét về khả năng thủy phân hemicellulose, một số protein được xác định là cĩ tham gia vào quá trình này. Các họ enzym lớn nhất tham gia vào quá trình phá vỡ cấu trúc của hemicellulose là GH43, GH31, GH127, GH51, GH10, GH36, và GH4, và tổng số các enzym được tìm thấy là 21. Trong số đĩ, chiếm nhiều nhất là GH43 (9 enzym), GH124 (3 enzym) và GH31 (2 enzym), điều này cho thấy chủng MP1 cĩ thể cĩ một tiềm năng lớn trong việc thủy phân và cắt các mạch nhánh trong cấu trúc hemicellulose. Các gen này được dự đốn bao gồm: mannan endo-1,4-β-
mannosidase, arabinoxylan arabinofuranohydrolase, α-xylosidase, α-L- arabinofuranosidase, β-L-arabinofuranosidase, endo-1,4-β-xylanase, α- galactosidase, và enzym đa chức năng β-xylosidase/α-arabinosidase. Chỉ cĩ 2 enzym là mannan endo-1,4-β-mannosidase và α-galactosidase đã được chứng minh về khả năng thủy phân mannan, thành phần quan trọng thứ 2 trong hemicellulose. 2 enzym endo-1,4-β-xylanase (Orf_100 và Orf_3772) và 1 enzym đa chức năng β- xylosidase/α-arabinosidase (Orf_3988) được gắn thêm CBM2 và CBM9. Một điều hiếm thấy là các gen mã hĩa các enzym arabinofuranosidase (orf_3999, orf_4000, orf_4001 và orf_4002), arabinoxylan arabinofuranohydrolase (orf_4003), và enzyme đa chức năng β-xylosidase/α-arabinosidase (orf_4004) lại được nhĩm với nhau và nằm trong cùng 1 operon.
Tương tự trong nghiên cứu của Chen và cộng sự (2019), ở nghiên cứu này vi khuẩn Micromonospora sp CP22 cũng cĩ khả năng sinh cellulase, xylanase và mananase được phân lập từ phân ủ của cây cọ dầu. Để đánh giá tiềm năng của chủng vi khuẩn tác giả đã nghiên cứu sâu hơn về bộ gen chủng CP22 bằng phương pháp giải trình tự, chú thích và phân tích bộ gen của vi khuẩn. Kết quả thu được chủng CP22 cĩ kích thước 5826203 bp với hàm lượng G+C là 70,84%. Phân tích chi tiết bộ gen về sự phân hủy lignocellulose cho thấy tổng cộng 60 gen bao gồm 47 gen liên quan đến sự thủy phân glycoside và 16 gen liên quan đến phân cắt liên kết este trong cacbohydrat. Đặc biệt, 20 gen mã hĩa cho cellulase (8 endoglucanase, 3 exoglucanase và 9 β-glucosidase) và 40 gen mã hĩa cho hemicellulose (15 endo- 1,4-β-xylanase, 3β-xylosidase, 3α-arabinofuranosidase, 10 acetyl xylan esterase, 6 polysacharide deacetylase, 1 β-mannanase, 1β-mannosidase và 1 α-galactosidase). Ba mươi gen mã hĩa modun liên kết carbohydrate (CBM). Các CBM này được tìm thấy trong 27 gen phân giải cellulose và hemicellulose, cho thấy vai trị tiềm năng của chúng trong việc tăng cường liên kết với cơ chất của các enzym. Các dữ liệu phân tích bộ gen của chủng CP22 đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc khám phá chủng vi khuẩn cĩ khả năng phân giải lignocellulose gĩp phần ứng dụng cơng nghệ sinh học trong thực tiễn [119].