2.3.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm. Trong đó, pha tĩnh silica gel 60 F254 (Merck) được tráng lên tấm nhôm kích thước 20x20 cm, pha động là dung môi hoặc hệ dung môi.
21
acetone), có nồng độ khoảng 2 mg/mL. Mẫu thử được chấm trên bản mỏng cùng với tác chất.
Dung môi giải ly: Chọn dung môi (hệ dung môi) giải ly thích hợp, sao cho giá trị Rf của vết sản phẩm dao động từ 0,1 đến 0,9 khi giải ly với 3 hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Một hệ cho Rf 0,2, một hệ cho Rf 0,5 và một hệ cho Rf 0,8. Mẫu thử được xem là tinh khiết nếu không có vết lạ xuất hiện trên bản mỏng sau khi giải ly với 03 hệ dung môi đã chọn. Các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau được điều chế từ
n-hexane và ethyl acetate. Một số hệ dung môi được sử dụng trong luận văn:
Hệ dung môi A: n-hexane:ethyl acetate (9:1 v/v) Hệ dung môi B: n-hexane:ethyl acetate (8:2 v/v) Hệ dung môi C: n-hexane:ethyl acetate (7:3 v/v) Hệ dung môi D: n-hexane:ethyl acetate (6:4 v/v) Hệ dung môi E: n-hexane:ethyl acetate (5:5 v/v) Giá trị Rf được tính toán như sau: Rf = 𝑥
𝑦
x là khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến trung tâm của vết sau khi triển khai (Hình 2.2).
y là khoảng cách từ điểm vết chấm đến mức tiền tuyến dung môi (Hình 2.2).
x y
Hình 2.2. Các xách định giá trị x, y trên bản mỏng
Phát hiện vết: Vết sản phẩm sau khi giải ly được soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm. Nếu vết sản phẩm không bắt màu UV thì có thể quan sát vết bằng cách nhúng bản mỏng vào dung dịch acid H2SO4 40% trong nước, sau đó nung nóng.
2.3.2.2. Phương pháp đo điểm nóng chảy
Do sản phẩm thu được đều ở dạng rắn nên đo nhiệt độ nóng chảy là một trong những phương pháp được sử dụng để xác định độ tinh khiết của sản phẩm. Nhiệt độ nóng
22
chảy được đo bằng máy Kruss M5000 tại Bộ môn Hóa Dược, Khoa Dược, Đại Học Lạc Hồng.
Benzoic acid tinh khiết được dùng làm chất chuẩn để kiểm tra độ chính xác của máy. Kết quả cho thấy, nhiệt độ nóng chảy của acid benzoic bằng 123,1 oC, đảm bảo tính chính xác của máy. Mẫu được cho vào ống vi quản kín một đầu, chiều cao mẫu trong ống vi quản từ 4÷6 mm. Nhiệt độ máy đo được cài đặt thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mẫu 2÷3 oC. Khi đạt được nhiệt độ cài đặt, mẫu tiếp tục được gia nhiệt với tốc độ 1 oC/phút. Khi mẫu nóng chảy hoàn toàn thì máy sẽ phát ra 3 tiếng bíp và nhiệt độ nóng chảy của mẫu sẽ hiện thị trên màn hình máy đo.
2.3.2.3. Phương pháp phổ
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ proton (1H – NMR) và phổ carbon (13C – NMR) được đo trên máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III spectrometer 500 MHz và 125 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. Sản phẩm được xem là tinh khiết khi các tín hiệu phổ của các nhóm chức trong sản phẩm tương ứng với các tín hiệu phổ của các nhóm chức trong phổ 1H – NMR và 13C – NMR.
Khối phổ (MS): Khối phổ được đo trên máy Finnigan Mat SSQ-7000 CI-MS tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.