Receptor – Cyclin dependent kinase 2 (CDK2)- 123docz.net

Cyclin-dependent kinases (CDKs) là một họ protein kinases tham gia vào quá trình điều tiết chu kỳ của tế bào. CDKs là các protein tương đối nhỏ, có trọng lượng phân tử từ 34 đến 40 kDa [47, 48]. Thông thường, một CDK sẽ liên kết với một protein điều tiết là Cyclin, nếu không có Cyclin thì CDK gần như bất hoạt. Tuy nhiên, khi tạo thành phức Cyclin-CDK thì trở nên hoạt hóa. Phức chất này sẽ xúc tác cho quá trình phosphate hóa các protein từ Adenosine triphosphate (ATP). Hầu hết các phức Cyclin- CDK điều tiết chu kỳ sống của tế bào. Tế bào động vật có ít nhất 09 loại protein CDK (CDK1-9), trong đó CDK1-4 tham gia trực tiếp vào quá trình điều tiết chu kỳ sống của tế bào. Vì vậy, các CDK liên quan trực tiếp đến các bệnh ung thư.

Hình 1.6. Cấu trúc của protein CDK2

Cấu trúc tinh thể của CDK2 được tìm kiếm và tải về từ ngân hàng dữ liệu protein (PDB – Protein Data Bank). Có nhiều cấu trúc tinh thể kết tinh của CDK2 được tìm thấy. Protein được lựa chọn phải có độ phân giải cao và ligand đồng kết tinh với protein là chất có hoạt tính ức chế CDK2 mạnh. Ngoài ra, mục tiêu tác động phải có khoang gắn kết đủ lớn thực hiện docking phân tử các dẫn xuất isoxazole và pyrazole curcumin. Vì thế, tinh thể đồng kết tinh của CDK2 với 5-(2-fluorophenyl)-N-(pyridin- 4-ylmethyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-amine (SCF) có độ phân giải 1.28 Å (PDB- 2R3I), IC50 = 1000 nM được chọn làm đích tác động trong nghiên cứu này. Tương tác giữa SCF với amino acid của protein được thể hiện trong Hình 1.7

Hình 1.7. Tương tác giữa SCF với protein CDK2 (ID: 2R3I) 1.5. Docking phân tử các dẫn xuất curcumin đối với 2R3I

Curcumin tương tác với các mục tiêu khác nhau trong quá trình phát triển của tế bào ung thư, trong đó có cả protein kinases [49]. Curcumin ức chế hoạt động của protein kinase C bằng cách hình thành liên kết hydrogen với Leu251 và Gln257. Ngoài ra, curcumin còn tương tác tốt với glycogen synthase kinase – 3b thông qua các liên kết với Val135, Ile62 và Arg141 [50]. Curcumin còn được xem là chất ức chế không cạnh tranh của photphorylase kinase [49].

CDK1-4 đóng vai trò quan trọng trong điều tiết chu kỳ tế bào, bất kỳ sự bất thường nào trong hoạt động của các CDK đều có khả năng dẫn đến sự phát triển thành tế bào ung thư. Phương pháp docking phân tử được sử dụng để nghiên cứu và mô phỏng các tương tác của curcumin với CDK, từ đó hình thành ý tưởng thiết kế các dẫn xuất mới từ curcumin để tạo ra các tương tác tốt hơn với CDK.

CDK2 đã được chọn làm mục tiêu docking với curcumin [51]. Kết quả docking cho thấy rằng, curcumin không tương tác tốt với CDK2 tại các vị trí liên kết của ATP [49]. Từ kết quả này, có thể nhận xét rằng curcumin không trực tiếp ức chế tế bào ung thư qua tương tác với CDK2 mà thông qua cơ chế khác. Vì thế, cần phải thiết kế các dẫn xuất curcumin mới mang các nhóm thế tương tác với CDK2 tốt hơn.

1.6. Điểm mới và tính cấp thiết của đề tài

Các nghiên cứu trước đây ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào curcumin được phân lập từ tinh bột nghệ, làm cơ sở cho việc tổng hợp các dẫn xuất khác từ curcumin. Đây là phương pháp kém hiệu quả vì tốn kém chi phí và thời gian phân lập. Điểm mới của phương pháp được sử dụng trong đề tài luận văn là tổng hợp toàn phần dẫn xuất curcumin từ chất nền p-methoxybenzaldehyde cho hiệu suất cao và tiết kiệm thời gian.

Các dẫn xuất curcumin như isoxazole, pyrazole curcumin,… có khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm,… đặc biệt là khả năng kháng ung thư trên nhiều dòng tế bào. Kết quả docking phân tử sẽ định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo trong thiết kế các dẫn xuất mới có hoạt tính tối ưu hơn. Nếu được nghiên cứu sâu hơn, các dẫn xuất curcumin có thể ứng dụng thiết kế thuốc chữa và phòng các bệnh ung thư.

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của khóa luận là các phản ứng tổng hợp dẫn xuất curcumin từ chất nền p-methoxybenzaldehyde với acetyl acetone, các phản ứng đóng vòng isoxazole, pyrazole từ nhóm 1,3 dicarbonyl và docking phân tử các dẫn xuất đối với Cyclin – dependent kinase 2 (CDK2).

2.2. Nguyên liệu, trang thiết bị thí nghiệm

2.2.1. Nguyên liệu

2.2.1.1. Nguyên liệu dùng trong tổng hợp

Các hóa chất dùng trong tổng hợp được cho trong Bảng 2.1:

Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong quy trình tổng hợp các dẫn xuất curcumin

từ chất nền p-methoxybenzaldehyde

STT Tên hóa chất Độ tinh

khiết Xuất xứ

1 p-methoxybenzaldehyde 98% Acros Organics

2 Acetyl acetone ≥ 99,5% Acros Organics

3 Hydroxylamine hydrochloride 99% Acros Organics

4 Hydrazine hydrate >80% Trung Quốc

5 Phenylhydrazine hydrochloride ≥99% Merck

6 n-Butylamine 99,5% Acros Organics

7 Tri-n-butyl borate* - -

8 Boron oxide 99% Acros Organics

9 Ethyl acetate ≥ 99,8% Merck

10 Acetic acid băng 99.5% Trung Quốc

11 Hydrocloric acid - Trung Quốc

12 Dichloromethane 99,9% Acros Organics

*Tổng hợp tại phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, Khoa CN Hóa học và Thực phẩm, ĐH Sư phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh

2.2.1.2. Nguyên liệu dùng trong kiểm nghiệm

- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck, Đức).

- Dung môi giải ly: n – hexane, ethyl acetate, acetone.

2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị

2.2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị dùng trong tổng hợp

- Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn (250 mL, 100 mL), erlen, beaker, pipet, micropipet, ống đong, phễu chiết.

- Máy khuấy từ gia nhiệt, cá từ. - Hệ thống sinh hàn.

- Hệ thống cô quay chân không. - Cân phân tích.

2.2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị dùng trong kiểm nghiệm

- Bình giải ly, ống vi quản. - Máy soi đèn UV.

- Máy đo điểm nóng chảy M5000 (Trường Đại học Lạc Hồng).

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân – NMR (Bruker), máy đo phổ khối lượng – MS (Agilent Technologies) (Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội).

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Tổng hợp

2.3.1.1. Tổng hợp tri-n-butyl borate

Cho 62,0 g acid boric (H3BO3, 1,0 mol) và 450,0 g n-butanol (6,0 mol, 555,0 mL) vào bình cầu một cổ 1,0 L, lắp hệ thống chưng cất và tiến hành gia nhiệt. Sau khi thu được 250,0 mL sản phẩm chưng cất, thêm 200,0 g n-butanol (247,0 mL) vào bình cầu và tiếp tục gia nhiệt đến khi nhiệt độ tăng vọt từ 117,0 oC đến 150,0 oC. Tiếp tục đun đến khi nhiệt độ đạt 220,0 oC thì dừng. Để nguội bình cầu, cho sản phẩm vào chai 250,0 mL Duran, đậy kín nắp để sử dụng cho phản ứng tổng hợp chất QT01.

2.3.1.2.Tổng hợp (1E,4Z,6E)-5-hydroxy-1,7-bis(4-methoxyphenyl)hepta-1,4,6-trien-3- one. (QT01)

khổ luận văn này, tôi chọn p-methoxybenzaldehyde làm chất nền, cho phản ứng với acetyl acetone để tổng hợp (1E,4Z,6E)-5-hydroxy-1,7-bis(4-methoxyphenyl)hepta - 1,4,6-trien-3-one.

Tiến hành phản ứng: Quy trình phản ứng được thực hiện theo quy trình đã được xuất bản trong tài liệu [52]. Trong bình cầu 250 mL, cho vào 1,03 mL acetyl acetone (10,0 mmol), 0,35 g boric oxide (10,0 mmol), 50,0 mL ethyl acetate, 2,44 mL p – methoxybenzaldehyde (20,0 mmol) và 10,8 mL tri-n-butylborate. Lắp ráp hệ thống như Hình 2.1, khuấy từ đến 80 oC và gia nhiệt trong vòng 30 phút.

Hình 2. 1. Hệ thống phản ứng tổng hợp (1E,4Z,6E)-5-hydroxy-1,7-bis(4-

methoxyphenyl)hepta -1,4,6-trien-3-one.

Sau 30 phút, nhỏ từ từ 0,4 mL n-butylamine (40% mole so với acetyl acetone, hòa tan trong 5,0 mL ethyl acetate) vào bình cầu bằng kim tiêm trong 30 phút, tiếp tục khuấy từ gia nhiệt ở 80 oC. Theo dõi tiến trình phản ứng bằng TLC. Kết quả TLC cho thấy sau 4 giờ, phản ứng đạt cân bằng. Sau đó, thêm 25,0 mL HCl 1,0 M vào hỗn hợp phản ứng, khuấy từ tại 80 oC trong 60 phút, kết thúc phản ứng.

Chiết: Hỗn hợp phản ứng được làm nguội, thêm dung dịch NaHCO3 (30,0 mL) bão hòa và chiết bằng ethyl acetate (315,0 mL). Gom dịch chiết ethyl acetate vào erlen. Làm khan nước bằng Na2SO4. Tiến hành lọc loại bỏ muối, thu dung dịch sản phẩm. Sử dụng máy cô quay chân không để loại dung môi thu sản phẩm thô.

Chuẩn bị dung môi giải ly cột và mẫu cho quá trình sắc ký cột: Dung môi giải ly đầu tiên được chọn là dung cho Rf của chất cần tinh sạch là 0,15 trên bản mỏng. Mẫu cần sắc ký được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong một lượng tối thiểu acetone và trộn chung với silica gel. Cho 4,0 g silica gel và 5,0 mL acetone vào sản phẩm thô (2,96 g) trong bình cầu 100 mL. Tiến hành cô quay để thu được bột khô sản phẩm thô và silica gel.

Chạy cột sắc ký và tinh sạch: Tỷ lệ silica gel so với mẫu là 50:1 về khối lượng. Silica gel được tạo hỗn hợp huyền phù với dung môi được chọn làm dung môi giải ly cột đầu tiên. Đường kính cột sắc ký được chọn sao cho tỷ lệ chiều cao silica gel và đường kính cột là 7:1. Đặt một lớp bông gòn dưới đáy cột để ngăn silica gel rơi xuống. Thêm dung môi giải ly vào cột, chiều cao dung môi khoảng 1,0 cm. Rót hỗn hợp huyền phù silica gel vào cột, dùng bóp cao su để silica gel được đồng đều trong cột. Thêm đầy dung môi vào cột, cân bằng cột bằng cách dùng bóp cao su đẩy dung môi ra khỏi cột 3 lần (không để khô dung môi trong cột). Nạp mẫu bột khô sản phẩm vào cột chứa silica gel. Tiến hành giải ly bằng (hệ) dung môi n-hexane:ethyl acetate có độ phân cực tăng dần. Dung dịch giải ly được hứng trong các hủ bi, tùy theo khoảng cách giữa các vết trên bản mỏng mà hứng lượng nhiều ít khác nhau. Độ tinh sạch của dịch giải ly được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Dịch giải ly trong các hủ bi được chấm và giải ly. Những hủ bi nào có kết quả giống nhau trong bản mỏng sau khi hiện hình bằng UV thì gom chung lại với nhau. Phân đoạn chứa chất quan tâm được cô quay đuổi dung môi để tiến hành các thí nghiệm hoặc tinh sạch tiếp nếu cần.

2.3.1.3. Tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)isoxazole (QT02)

3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)isoxazole được tổng hợp từ phản ứng giữa (1E,4Z,6E)-5- hydroxy-1,7-bis(4-methoxyphenyl)hepta -1,4,6-trien-3-one và hydroxylamine. Acetic acid được sử dụng làm dung môi phản ứng và xúc tác.

Tiến hành phản ứng: Quy trình được thực hiện theo quy trình đã được xuất bản trong tài liệu [30]. Hòa tan 200,0 mg (0,595 mmol) hợp chất QT01 bằng 10,0 mL acetic acid

trong bình cầu 100 mL. Lắp đặt hệ thống phản ứng như Hình 2.1. Gia nhiệt kết hợp khuấy từ ở 80 oC trong 30 phút. Sau đó, cho 82,74 mg hydroxylamine hydrochlodride (NH2OH.HCl) vào bình cầu. Theo dõi phản ứng bằng TLC. Kết quả TLC cho thấy phản ứng kết thúc sau 9h.

Chiết: Hỗn hợp phản ứng được làm nguội, trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 bão hòa (50,0 mL) và chiết bằng dichloromethane (3x15,0 mL). Gom các dịch chiết dichloromethane vào bình erlen, làm khan nước bằng Na2SO4. Hỗn hợp được lọc qua phễu lọc Buchner thu dung dịch dichloromethane. Đuổi dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cô quay chân không thu được chất rắn thô.

Tinh chế: Sản phẩm thô được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần từ 100% n-hexane đến n-hexane:ethyl acetate (95:5 v/v)

2.3.1.4. Tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-4H-pyrazole (QT03)

3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-4H-pyrazole được tổng hợp từ phản ứng giữa (1E,4Z,6E)-5-hydroxy-1,7-bis(4-methoxyphenyl)hepta -1,4,6-trien-3-one và hydrazine hydrate. Acetic acid được sử dụng làm dung môi phản ứng và xúc tác.

Tiến hành phản ứng: Quy trình được thực hiện theo quy trình đã được xuất bản trong tài liệu [30]. Hòa tan 200,0 mg (0,595 mmol) hợp chất QT01 bằng 10,0 mL acetic acid trong bình cầu 100 mL. Gia nhiệt kết hợp khuấy từ ở 80 oC trong 30 phút. Sau đó, cho 58,0 µL hydrazinehydrate (N2H4.H2O) vào bình cầu. Theo dõi phản ứng bằng TLC. Kết quả TLC cho thấy phản ứng kết thúc sau 6h.

Tinh chế: Sản phẩm thô được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần từ 100% n-hexane đến n-hexane:ethyl acetate (8:2 v/v)

2.3.1.5. Tổng hợp 3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-1-phenyl-1H-pyrazole (QT04)

3,5-bis((E)-4-methoxystyryl)-1-phenyl-1H-pyrazole được tổng hợp từ phản ứng giữa (1E,4Z,6E) -5 - hydroxy - 1,7 - bis (4 - methoxyphenyl) hepta -1,4,6- trien - 3 - one và phenylhydrazine hydrocloride. Acetic acid được sử dụng làm dung môi phản ứng và xúc tác.

Tiến hành phản ứng: Quy trình được thực hiện theo quy trình đã được xuất bản trong tài liệu [30]. Hòa tan 200,0 mg (0,595 mmol) hợp chất QT01 bằng 10,0 mL acetic acid trong bình cầu 100 mL. Gia nhiệt kết hợp khuấy từ ở 80 oC trong 30 phút. Sau đó, cho 173,0 mg phenylhydrazine hydrochloride (C6H5-NH-NH2.HCl) vào bình cầu. Theo dõi phản ứng bằng TLC. Kết quả TLC cho thấy phản ứng kết thúc sau 6h.

2.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc hóa học

2.3.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm. Trong đó, pha tĩnh silica gel 60 F254 (Merck) được tráng lên tấm nhôm kích thước 20x20 cm, pha động là dung môi hoặc hệ dung môi.

acetone), có nồng độ khoảng 2 mg/mL. Mẫu thử được chấm trên bản mỏng cùng với tác chất.

Dung môi giải ly: Chọn dung môi (hệ dung môi) giải ly thích hợp, sao cho giá trị Rf của vết sản phẩm dao động từ 0,1 đến 0,9 khi giải ly với 3 hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Một hệ cho Rf  0,2, một hệ cho Rf  0,5 và một hệ cho Rf  0,8. Mẫu thử được xem là tinh khiết nếu không có vết lạ xuất hiện trên bản mỏng sau khi giải ly với 03 hệ dung môi đã chọn. Các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau được điều chế từ

n-hexane và ethyl acetate. Một số hệ dung môi được sử dụng trong luận văn:

 Hệ dung môi A: n-hexane:ethyl acetate (9:1 v/v)  Hệ dung môi B: n-hexane:ethyl acetate (8:2 v/v)  Hệ dung môi C: n-hexane:ethyl acetate (7:3 v/v)  Hệ dung môi D: n-hexane:ethyl acetate (6:4 v/v)  Hệ dung môi E: n-hexane:ethyl acetate (5:5 v/v) Giá trị Rf được tính toán như sau: Rf = 𝑥

𝑦

 x là khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến trung tâm của vết sau khi triển khai (Hình 2.2).

 y là khoảng cách từ điểm vết chấm đến mức tiền tuyến dung môi (Hình 2.2).

x y

Hình 2.2. Các xách định giá trị x, y trên bản mỏng

Phát hiện vết: Vết sản phẩm sau khi giải ly được soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm. Nếu vết sản phẩm không bắt màu UV thì có thể quan sát vết bằng cách nhúng bản mỏng vào dung dịch acid H2SO4 40% trong nước, sau đó nung nóng.

2.3.2.2. Phương pháp đo điểm nóng chảy

Do sản phẩm thu được đều ở dạng rắn nên đo nhiệt độ nóng chảy là một trong những phương pháp được sử dụng để xác định độ tinh khiết của sản phẩm. Nhiệt độ nóng

chảy được đo bằng máy Kruss M5000 tại Bộ môn Hóa Dược, Khoa Dược, Đại Học Lạc Hồng.

Benzoic acid tinh khiết được dùng làm chất chuẩn để kiểm tra độ chính xác của máy. Kết quả cho thấy, nhiệt độ nóng chảy của acid benzoic bằng 123,1 oC, đảm bảo tính chính xác của máy. Mẫu được cho vào ống vi quản kín một đầu, chiều cao mẫu trong

Receptor – Cyclin dependent kinase 2 (CDK2)

Các dẫn xuất isoxazole và pyrazole của curcumin

Tình hình nghiên cứu ngoài nước