1.4.1. Nghiên cứu trong nước
Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật vi bao có khả năng bảo vệ vi khuẩn lactic trong môi trường bất lợi. Tiêu biểu là qua báo cáo của nhóm tác giả Nguyễn Thuý Hương và cộng sự (2009). Bài báo trình bày về nghiên cứu nâng cao hoạt tính probiotic vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus với 4 kích thước hạt vi gói vi khuẩn từ gel Natri - alginate là: 2,0 mm; 1,5 mm; 1,0 mm và 0,5 mm. Trong đó, hạt vi gói kích thước 1,0 mm cho hiệu quả bảo vệ hoạt tính probiotic của vi khuẩn là cao nhất, cụ thể là trong môi trường axit dạ dày nhân tạo (SGJ) và môi trường muối mật (tương đương môi trường khắc nghiệt của hệ tiêu hóa), vi gói 1mm giữ được khoảng 60% tế bào sống (bao gồm tế bào trong vi gói và tế bào phóng thích) với thời gian khảo sát là 60 phút. Cũng trong cùng điều kiện trên, tỉ lệ phóng thích tế bào sống sót ra ngoài dịch khảo sát là hơn 25% so với mật độ tế bào ban đầu. Kích thước vi gói càng lớn, khả năng sống sót của tế bào càng cao, nhưng tỷ lệ phóng thích tế bào càng giảm trong cùng điều kiện. Bên cạnh đó bài báo cáo của tác giả Nguyễn Thúy Hương và cộng sự (2008) về sự hao hụt của vi khuẩn lactic trong môi trường sữa chua có độ axit cao, tác giả đã tiến hành vi gói hai chủng L.bulgaricus và Streptococcus thermophillus
bằng phương pháp nhốt trong nati alginate. Nghiên cứu này cho thấy hạt có kích thước 1.2 mm vừa có thể bảo vệ vi khuẩn vừa không làm thay đổi tính chất cảm quan của sữa chua đậu nành. Nhóm nghiên cứu Liêu Mỹ Đông và cộng sự (2011) đã sử dụng hỗn hợp alginate – xathan để vi gói vi khuẩn B. bifidum nhằm nâng cao hoạt tính probiotics của vi khuẩn này.
16
Kết quả cho thấy, khi nồng độ Ca-alginat được giữ cố định là 2.5% thì hiệu quả bảo vệ tăng theo chiều tăng nồng độ Xanthan gum từ 0.1 đến 0.2% và đạt hiệu quả cao nhất ở 0.2%. Nhóm nghiên cứu Trần Huỳnh Như (2014) đã sử dụng tinh bột, maltodextrin vào trong quá trình bao gói S. boulardii trong gel alginate bằng phương pháp nhỏ giọt, kết quả cho thấy sau khi bao gói thì mẫu bổ sung 1.00%, 1.25% w/v tinh bột và mẫu bổ sung 1.00% w/v maltodextrin cho hiệu suất bao gói cao nhất [71].
Hình 1.8. Đặc điểm mặc ngoài của hạt vi bao khi quan sát dưới kính hiển vi quét điện tử.
A,B; C,D và E,F lần lượt là mẫu hạt vi bao sau sấy chứa alginate, mẫu hạt vi bao sau sấy bổ sung tinh bột, mẫu hạt vi bao sau sấy bổ sung maltodextrin
B
D A
C
17
1.4.2. Nghiên cứu ngoài nước
Nghiên cứu của Lee và cộng sự (2000) cho rằng tỷ lệ sống sót của Bifidobacteria longum KCTC 3128 và HLC 3742 trong dịch dạ dày và muối mật được cải thiện một cách đáng kể khi cố định chúng trong các hạt calcium alginate có chứa 2, 3, 4% natri alginate. Họ kết luận rằng, tỷ lệ chết của Bifidobacteria longum giảm tỷ lệ với việc tăng cả nồng độ gel alginate và kích thước hạt.
Nhóm nghiên cứu Nitin W. Fadnavis và cộng sự (2003) đã chứng minh rằng hỗn hợp polysaccharide sodium alginate 5% và gelatin 3% liên kết ngang với glutaraldehyde (kết hợp với canxi clorua) tạo hạt vi bao bền vững dưới cường độ nén 8x104 Pa. Các enzyme như lipase từ tuyến tụy của lợn, Pseudomonas cepacia và Candida rugosa được cố định trong hỗn hợp này có hiệu quả cao vì việc cố định này duy trì hoạt động enzyme rất tốt. Kết quả cho thấy trên bề mặt hạt vi bao có đường rãnh dài 17-20 µm và độ sâu của rãnh là 3-8 µm (Hình 2.1 C, D) [54]. Yoav Bashan và cộng sự (2002) đã tiến hành cấy những hạt vi bao
Azospirillum brasilense ướt và khô lên môi trường thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn (PGPB). Các hạt vi bao được tạo ra từ vòi phun có kích thước nhỏ phun dung dịch alginate trộn với huyền phù vi khuẩn dưới áp suất thấp tạo thành giọt. Những giọt này cho tiếp xúc với dung dịch CaCl2 đông cứng lại và có đường kính từ 100-200 mm. So với mẫu chỉ dùng alginate không bổ sung lecithin trên bề mặt hạt sấy có nhiều đường nứt khá sâu (Hình 2.1 A, B). Mặc dù quá trình này làm chết một số vi khuẩn bị nhốt nhưng số vi khuẩn còn lại là 2×1011 cfu/g. Nhóm nghiên cứu này không chỉ khảo sát hạt ướt mà còn tiến hành làm khô hạt bằng cách cho sử dụng không khí khô ở 380C. Sau khi làm khô số tế bào sống sót còn lớn hơn 3×109 cfu/g[77].
V. Chandramouli và cộng sự đã vi bao Lactobacillus acidophilus CSCC 2400 trong canxi alginate và kiểm tra khả năng sống sót của nó trong điều kiện dạ dày. Điều này phụ thuộc vào kích thước hạt (200, 450, 1000 µm), nồng độ natri alginate (0.75%, 1%, 1.5%, 1.8%, 2% %w/v) và nồng độ canxi clorua khác nhau (0.1, 0.2 và 1.0 M). Nghiên cứu chứng minh rằng khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilus CSCC 2400 tăng khi tăng kích thước hạt vi bao và tăng nồng độ natri alginate. Tuy nhiên nồng độ canxi clorua ít gây ảnh hưởng. Không có sự khác biệt đáng kể (p < 0.05) trong sự tồn tại các tế bào được vi bao khi nồng độ canxi clorua được tăng lên. Khi cho L.acidophilus CSCC 2400 và L.acidophilus
CSCC 2409 (được vi bao trong điều kiện tối ưu 1.8% (%w/v) alginate, 109 cfu/ml, 0.1 M CaCl2 và kích thước viên nang 450 mm) trong điều kiện pH = 2, nồng độ muối mật là 1%,
18
có sự khác biệt đáng kể (p < 0.05) so với tế bào tự do. Do đó, kết quả nghiên cứu có thể áp dụng để bảo vệ vi khuẩn có lợi trong điều kiện bất lợi của dịch dạ dày [73].
Ding và cộng sự (2007) tiến hành vi gói với nồng độ alginate 3% trên 8 loại vi khuẩn khác nhau: L. rhamnosus, B. longum, L. salivarius, L. plantarum, L. acidophilus, L. paracasei, B. lactis Bl-O4 và B. lactis Bi-07. Kết quả thí nghiệm cho thấy alginate có khả năng bảo vệ tế bào vi sinh vật trong các điều kiện môi trường cực đoan như axit của dạ dày (pH=2), muối mật (3%) và nhiệt độ cao (650C trong 30 phút). Báo cáo chỉ ra rằng, vi khuẩn probiotic được vi gói sống sót tốt hơn vi khuẩn tự do. Trong môi trường có bổ sung muối mật 3%, tế bào vi khuẩn tự do giảm 6.51 log (CFU/ml), trong khi chỉ giảm 3.36 log (CFU/ml) ở vi khuẩn được vi gói trong thời gian là 8 giờ. Sau 30 phút xử lý nhiệt độ 650C, tế bào vi khuẩn không được vi gói giảm 6.74 log (CFU/ml) trong khi tế bào được vi gói chỉ giảm 4.17 log (CFU/ml) [23].
19
Hình 1.9. A,B - Cấu trúc mặt ngoài của vi gói Azospirillum trong nghiên cứu của Yoav Bashan; C,D - Cấu trúc mặt ngoài hạt vi gói trong nghiên cứu Nitin W.
Fadnavis
A B
20
1.5. Định hướng nghiên cứu
Thông qua các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước, chúng tôi nhận thấy rằng kỹ thuật bao gói sử dụng alginate riêng lẻ hoặc kết hợp với các chất bảo vệ khác nhau cũng như nghiên cứu quá trình sấy loại bỏ nước nhằm tiết kiệm chi phí vận chuyển, bảo quản mà vẫn giữ được hoạt tính probiotic đang là đề tài được nhiều sự quan tâm. Đề tài chúng tôi thực hiện cũng không nằm ngoài mục đích trên và đây cũng là nghiên cứu đầu tiên thực hiện việc khảo sát khả năng sống sót của tế bào S. boulardii được bao gói trong alginate (có bổ sung maltodextrin) kết hợp sấy đối lưu trong môi trường dịch dạ dày và dịch ruột.
21
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm thực hiện
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh và Hóa sinh Bộ môn Công nghệ hóa học và Thực phẩm, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại Học Sư Phạm Kĩ Thuật TP.HCM.
2.2. Vật liệu
Vi sinh vật: Nấm men S. boulardii (BiofloraTM, hãng Biocodex, Pháp).
Hóa chất: Natri – alginate (Xilong chemical, China), CaCl2 (Guangdong Guanghua, China), maltodextrin. Dung dịch đệm phosphate 0.1 M có pH 7.0 (gồm 8 g NaCl (Xilong chemical, China), 0.2 g KCl (Xilong chemical, China), 1.44 g Na2HPO4 (Xilong chemical, China), 0.24 g KH2PO4 (Xilong chemical, China)), môi trường Hansen (trong 100 ml môi trường chứa glucose (Xilong chemical, China), 10 g, pepton 1g, KH2PO4 0.3 g, MgSO4.7H2O (Xilong chemical, China) 0.2 g, chloramphenicol 40 ppm) dạng lỏng và dạng bán rắn (bổ sung thêm 2% Agar (Vietxoco. Việt Nam), nước muối sinh lý (NaCl 0.9%), môi trường giả lập dịch dạ dày (0.08M HCl (Xilong chemical, China), 0.2% NaCl, pH 1.5), dịch ruột (0.05 M KH2PO4, pH 7.25, 0.6% muối mật).
2.3. Phương pháp thực hiện
2.3.1. Bao gói S. boulardii với natri alginate có bổ sung maltodextrin
Hoạt hóa S.boulardii ở 300C trong 24 giờ trong 10 ml môi trường Hansen, tiếp đến chuyển toàn bộ sang bình có chứa 100 ml môi trường Hansen nuôi cấy cùng điều kiện. Quá trình nhân giống thực hiện trong điều kiện hiếu khí, sử dụng thiết bị khuấy từ với tốc độ 300 vòng/phút. Sau 12 giờ kết thúc quá trình nuôi cấy và thu sinh khối, 100 ml huyền phù được ly tâm một lần với tốc độ 4000 rpm trong 10 phút, sau đó được rửa với 100 ml nước muối sinh lý (0.9% NaCl, 40C) trộn đều cặn và ly tâm lần 2 theo điều kiện như trên. Tế bào S. boulardii được rửa 2 lần, lần đầu với nước muối sinh lý, lần sau với nước cất vô trùng, sau đó thu sinh khối và chuẩn bị cho quá trình vi bao. Chất bao là dung dịch alginate 2% (w/v) có bổ sung 1.00% (w/v) maltodextrin (HiMedia, India). Dung dịch alginate được ngâm 24 giờ để alginate được hòa tan hoàn toàn, sau đó tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút trước khi dùng. Maltodextrin được hòa tan với nước cất rồi bổ sung vào dung dịch alginate ở điều kiện thường. Cho sinh khối thu được sau ly tâm được vào 200 ml dung dịch alginate 2% (w/v) có
22
bổ sung maltodextrin 1.00% (w/v), khuấy điều hỗn hợp bằng máy khuấy từ với tốc độ 300 vòng/ phút, thực hiện ở 40C trong 15 phút để các thành phần được hòa tan vào nhau hoàn toàn. Quá trình bao gói được thực hiện bằng cách dùng bơm kim tiêm nhỏ giọt hỗn hợp trên vào dung dịch CaCl2 0.75% đặt trên mấy khuấy từ để các hạt không dính vào nhau. Tỷ lệ hỗn hợp alginate và S.boulardii với dung dịch CaCl2 là 1 : 5. Các thao tác với S.boulardii
thực hiện ở điều kiện 40C. Sau khi kết thúc quá trình nhỏ giọt, dung dịch CaCl2 chứa hạt bao gói được giữ ở 40C trong 30 phút để hạt bao ổn định cấu trúc. Sau đó tiến hành lọc hạt qua rây, rửa với 200 ml nước muối sinh lý và 200 ml nước cất, làm ráo lúc này thu được mẫu hạt tươi (T). Tiếp theo, cho mẫu T vào tủ sấy đối lưu trong 5 giờ ở 400C, thu được mẫu hạt sấy (S). Một phần mẫu T được đem đi nghiền mịn, lúc này thu được mẫu hạt sấy nghiền (SN) để tiến hành khảo sát. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô trùng [71].
2.3.2. Khảo sát đường cong sinh trưởng của S. boulardii
Nhân giống cấp 1 bằng cách chuyển giống từ ống thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 10 ml môi trường Hansen lỏng, ủ 48 giờ ở 300C. Nhân giống cấp 2 bằng cách chuyển giống từ ống nghiệm cấp 1 sang bình cầu 100 ml trong điều kiện 300C có khuấy lắc. Sau mỗi giờ lấy mẫu trải đĩa kiểm tra mật độ tế bào 1 lần. Khảo sát và dựng đường cong sinh trưởng.
2.3.3. Khảo sát cấu trúc tinh thể của hạt bao alginate sau khi sấy
Chuẩn bị 3 hỗn hợp : mẫu chỉ chứa 2% alginate (a); mẫu có chứa 2% alginate và 1% maltodextrin (b); mẫu có chứa 2% alginate, 1% maltodextrin và 100 ml sinh khối S. boulardii
thu được sau ly tâm (c). Tiến hành dùng bơm kim tiêm nhỏ giọt hỗn hợp X (a, b hoặc c) vào dung dịch CaCl2 0.75% đặt trên máy khuấy từ. Tỷ lệ hỗn hợp X với dung dịch CaCl2 là 1:5. Sau khi kết thúc quá trình nhỏ giọt dung dịch CaCl2 chứa hạt bao gói được giữ ở 40C trong 30 phút để hạt bao ổn định cấu trúc. Sau đó tiến hành lọc hạt qua rây, rửa với 200 ml nước muối sinh lý và 200 ml nước cất, làm ráo rồi cho hạt vào tủ sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ thu được hạt bao sau sấy [71]. Khi X tương ứng với a thì thu được mẫu hạt bao sau khi sấy chỉ chứa alginate (A); X tương ứng với b thì lúc này thu được mẫu hạt bao sau khi sấy chứa alginate có bổ sung maltodextrin (B); X tương ứng với c thì thu được mẫu hạt bao sau khi sấy chứa alginate có bổ sung maltodextrin và S.boulardii (C). Cấu trúc tinh thể của hạt bao alginate sau khi sấy được thể hiện qua mô hình nhiễu xạ tia X (Miniflex gonio Meter, Nhật Bản), tiếp xúc với bức xạ Cu (30kv × 15 mA), phạm vi quét từ 10 đến 900 (2θ) [66].
23
2.3.4. Đánh giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trường giả lập dịch dạ dày và dịch ruột. dày và dịch ruột.
a. Khảo sát trong môi trường giả lập dịch dạ dày
Cho 1 g hạt vi gói vào 10 ml môi trường giả lập dạ dày vô trùng (0.08M HCl, 0.2% NaCl, pH 1.5) không có pepsin và ủ ở 370C đến 120 phút. Sau khi ủ các hạt ở các khoảng thời gian khác nhau tiến hành rửa bằng dung dịch peptone 0.1% (10 ml). Tiến hành trãi đĩa đếm tế bào (cho 1 g hạt vi gói vào 9 ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M có pH 7.0 lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút, tiến hành trãi đĩa) Thực hiện 3 lần lặp lại. Theo dõi mật độ vi khuẩn S. boulardii tại các thời điểm [52].
b. Khảo sát trong môi trường mô phỏng dịch ruột
Tiến hành thí nghiệm: 1 g hạt vi gói ngâm trong 10 ml dung dịch axit trong dạ dày mô phỏng (0.08 M HCl, 0.2% NaCl, pH 1.5) mà không pepsin và ủ 370C trong 60 phút. Sau khi ủ, lấy ra trung hòa bằng NaOH sao đó cho vào 9 ml nước vô trùng đường ruột mô phỏng (0.05M KH2PO4, pH 7.25, 0.6% muối mật) rồi đem ủ ở 370C đến 120 phút. Tiến hành trãi đĩa đếm tế bào (cho 1 g vi gói vào 9 ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M có pH 7.0 lắc nhẹ nhàng ở nhiệt độ phòng trong 60 phút, tiến hành trãi đĩa) Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi mật độ vi khuẩn S.boulardii tại các thời điểm [52].
2.3.5. Khảo sát mật độ tế bào theo thời gian lưu trữ của hạt bao gói
Tiến hành thí nghiệm: Lưu trữ các mẫu gồm: mẫu đối chứng (ĐC) là sinh khối thu được sau ly tâm; hạt bao tươi (T) ; hạt bao đã sấy đối lưu ở 400C, trong 5 giờ (S); hạt bao đã sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ và nghiền (SN). Tiến hành khảo sát các mẫu ở hai khoảng nhiệt độ lưu trữ là 50C, 300C và theo dõi mật độ tế bào đến 12 ngày.
2.3.6. Khảo sát khả năng tồn tại của S. boularddi trong môi trường giả lập dạ dày và dịch mật sau khi 12 ngày lưu trữ. và dịch mật sau khi 12 ngày lưu trữ.
Cách tiến hành: sau 12 ngày lưu trữ các mẫu (mẫu đối chứng (ĐC) là sinh khối thu được sau ly tâm; hạt bao tươi (T); hạt bao đã sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ (S); hạt bao đã sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ nghiền (SN)) ở hai khoảng nhiệt độ 50C và 300C, tiến hành
24
thí nghiệm khảo sát trong môi trường dịch dạ dày và dịch ruột (như mục 2.3.4 ) ở mốc thời gian 120 phút.
2.3.7. Phương pháp phân tích thu nhận kết quả
a. Phương pháp phân tích hóa sinh
Xác định pH dung dịch đệm bằng máy đo pH Eutech instruments pH 510, xác định độ ẩm bằng tủ sấy đối lưu.
Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đối lưu đến khối lượng không đổi, sử dụng thiết bị sấy đối lưu.Công thức xác định độ ẩm:
% Độ ẩm = 100 w w w f i i
Trong đó: wf, wi lần lượt là khối lượng của nguyên liệu trước và sau quá trình sấy (AOAC, 1984).
b. Phương pháp phân tích vi sinh
Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc trên đĩa petri bằng kỹ thuật trải đĩa trên môi trường Hansen.
Mật độ tế bào = 𝑁
𝑛1.𝑓1.𝑉+𝑛2.𝑓2.𝑉+⋯+𝑛𝑛.𝑓𝑛.𝑉
Trong đó: N là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa (chỉ lấy các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 và nồng độ pha loãng là liên tiếp nhau). n là số đĩa ở nồng độ pha loãng f. V là thể tích mẫu đưa vào đĩa (ml) [29].
Chúng tôi tiến hành bao gói 50 ml huyền phù nấm men. Sau quá trình bao gói thu được 38.22 ± 0.09 g hạt tươi, sau khi sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ thu được 2.45 ± 0.04 g hạt khô. Qui về g hạt tươi sẽ được:
1 g hạt = 1 g hạt tươi (T) = 0.0641 g hạt sấy (S) = 0.0641 g hạt sấy nghiền (SN) = 1.31 ml huyền phù nấm men (ĐC).
c. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, thực hiện hoàn toàn ngẫu nhiên. Kết quả được