a. Phương pháp phân tích hóa sinh
Xác định pH dung dịch đệm bằng máy đo pH Eutech instruments pH 510, xác định độ ẩm bằng tủ sấy đối lưu.
Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đối lưu đến khối lượng không đổi, sử dụng thiết bị sấy đối lưu.Công thức xác định độ ẩm:
% Độ ẩm = 100 w w w f i i
Trong đó: wf, wi lần lượt là khối lượng của nguyên liệu trước và sau quá trình sấy (AOAC, 1984).
b. Phương pháp phân tích vi sinh
Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc trên đĩa petri bằng kỹ thuật trải đĩa trên môi trường Hansen.
Mật độ tế bào = 𝑁
𝑛1.𝑓1.𝑉+𝑛2.𝑓2.𝑉+⋯+𝑛𝑛.𝑓𝑛.𝑉
Trong đó: N là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa (chỉ lấy các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 và nồng độ pha loãng là liên tiếp nhau). n là số đĩa ở nồng độ pha loãng f. V là thể tích mẫu đưa vào đĩa (ml) [29].
Chúng tôi tiến hành bao gói 50 ml huyền phù nấm men. Sau quá trình bao gói thu được 38.22 ± 0.09 g hạt tươi, sau khi sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ thu được 2.45 ± 0.04 g hạt khô. Qui về g hạt tươi sẽ được:
1 g hạt = 1 g hạt tươi (T) = 0.0641 g hạt sấy (S) = 0.0641 g hạt sấy nghiền (SN) = 1.31 ml huyền phù nấm men (ĐC).
c. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, thực hiện hoàn toàn ngẫu nhiên. Kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê IBM SPSS Statistics 20, phần mềm Excel versions 2013.
25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đường cong sinh trưởng của S. boulardii
Từ Hình 3.1. cho thấy, mật độ tế bào S.boulardii tăng liên tục và đạt cực đại (8.70 log cfu/ml) vào giờ thứ 12 của quá trình nuôi cấy sau đó mật độ tế bào có xu hướng giảm dần, S.boulardii bắt đầu bước vào pha ổn định rồi pha suy vong. Với hàm lượng đường 10%, đường cong sinh trưởng của S. boulardii có đặc điểm pha thích nghi kéo dài 2 giờ, pha sinh trưởng kéo dài 12h (Hình 3.1), vì vậy thời điểm thu nhận sinh khối thích hợp là vào giờ thứ 12.
26
Hình 3.1. Đường cong sinh trưởng S. boulardii
Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn 7.0 7.4 7.8 8.2 8.6 9.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 L o g CF U/m l
27
3.2. Đặc điểm hạt vi bao S. boulardii
3.2.1. Hình dạng hạt vi bao sau khi vi bao
Hạt vi bao: tròn hoặc elip màu trắng đục, mềm do hàm lượng nước cao, kích thước hạt từ 2.5 – 3.0 mm (Hình 3.2. A.). Áp dụng phương pháp nhỏ giọ, R. Vidhyalakshmi cho rằng đường kính hạt vi bao khoảng 2000 µm [74]. Parthiban Muthukumarasamy đã vi bao
Lactobacillus reuteri bằng alginate theo phương pháp nhỏ giọt. Kết quả hạt vi bao có đường kính 2-3 mm [57]. Như vậy so với những nghiên cứu trước đó, đường kính hạt vi bao trong nghiên cứu của chúng tôi to hơn. Điều này có thể do kích thước đầu mũi ống tiêm của chúng tôi lớn hơn và tế bào nấm men có kích thước lớn hơn tế bào lactic. Đồng thời khoảng cách từ ống tiêm xuống dung dịch alginate và tốc độ khuấy khi nhỏ giọt cũng gây ảnh hưởng đến kích thước tế bào.
3.2.2. Hình dạng hạt sau khi sấy
Hạt sau khi sấy: có màu vàng nâu, đường kính khoảng 0.5 – 1.5 mm, độ cứng tăng so với hạt vi bao ban đầu (Hình 3.2. B). Chúng tôi cho rằng hạt chuyển sang màu vàng nâu có thể do trong thành phần màng tế bào nấm men có chứa lipid, do đó trong quá trình sấy đối lưu có thể xảy ra phản ứng peroxyde hóa làm biến đổi màu của hạt sau khi sấy. Hạt vi bao sau khi sấy bị biến dạng do chịu ảnh hưởng của nhiệt độ trong thời gian khá dài và trong quá trình sấy chúng tôi tiến hành đảo hạt 30 phút/1 lần để sấy đều các mặt.
28
A. Trước khi sấy B. Sau khi sấy
29
3.3. Đánh giá mật độ kết tinh của hạt bao gói sau khi sấy
Sự kết tinh của hạt bao gói sau khi sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ được thể hiện ở
Hình 3.3. Sự hiện diện của các đỉnh cho thấy hạt bao có bổ sung thêm các thành phần khác (bổ sung maltodextrin và S.boulardii) vẫn còn giữ được trạng thái tinh thể so với mẫu A. Kết quả cho thấy sau khi sấy thì cấu trúc mẫu C gần như không có sự thay đổi so với mẫu B, mặc dù trong 3 mẫu hạt có xuất hiện những đỉnh nhỏ ở những góc khác nhau trên từng mẫu hạt, nhưng nhìn chung đỉnh nhọn đặc trưng cho cấu trúc tinh thể alginate không có sự khác biệt. Trong nghiên cứu của Liangbin Li (2007), gel calcium alginate cho cấu trúc tinh thể với 22.90 là đỉnh chính [39]. Kết quả cho chụp nhiễu xạ tia X của các mẫu hạt bao alginate của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của Liangbin Li. Như vậy khi bổ sung S. boulardii
và maltodextrin vào alginate thì không làm ảnh hưởng đến trạng thái kết tinh của hạt gel, chính vì thế mà mạng tinh thể của hạt bao được ổn định cấu trúc, tế bào S. boulardii được bao bọc, bảo vệ tốt làm tăng khả năng chống chịu của S. boulardii trong các điều kiện khắc nghiệt như trong môi trường dạ dày, muối mật.
30
Hình 3.3. Nhiễu xạ tia X của các mẫu hạt bao sau khi sấy
A: Mẫu hạt chỉ chứa natri alginate sau khi sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ
B: Mẫu hạt chứa natri alginate có bổ sung maltodextrin sau khi sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ C: Mẫu hạt chứa natri alginate có bổ sung maltodextrin và S. boilardii sau khi sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 C ườn g độ tươn g đố i 2ϴ A B C
31
3.4. Đánh giá khả năng sống sót của S. boulardii trong môi trường giả lập dịch dạ dày và dịch ruột. và dịch ruột.
Sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường giả lập dạ dày được thể hiện ở Hình 3.4. Kết quả cho thấy mật độ tế bào sống sót tỉ lệ nghịch với thời gian ngâm hạt bao gói trong môi trường giả lập dạ dày. Kết quả tương đồng với nghiên cứu của R.R Mokarram (2009) khi khảo sát L.acidophilus PTC1643 và L.rhamnosus PTCC1637 được bao gói trong môi trường giả lập dạ dày. Tại thời điểm 0 giờ mật độ tế bào của mẫu ĐC và mẫu T là không có sự khác biệt cụ thể là ở mẫu ĐC mật độ tế bào là 7.50 ± 0.03 log CFU/g hạt và mẫu T là 7.46 ± 0.05 log CFU/g hạt , trong khi đó so với mẫu ĐC thì mật độ tế bào ở mẫu S và SN có sự khác biệt đáng kể (mẫu S có mật độ tế bào là 6.57 ± 0.03 log CFU/g hạt, mẫu SN là 4.61 ± 0.02 log CFU/g hạt). Chúng tôi cho rằng quá trình bao gói thực hiện ở điều kiện nhiệt độ 40C ít làm ảnh hưởng đến tế bào nên mật độ tế bào giữa mẫu ĐC và T không có sự khác biệt, tuy nhiên đối với mẫu S và SN thì sau quá trình sấy, do bị sốc nhiệt và mất nước nên mật độ tế bào giảm, thêm vào đó dưới tác động của lực cơ học trong quá trình nghiền hạt làm cho mật độ tế bào ở mẫu SN thấp. Nhìn chung mức độ giảm mật độ tế bào sau khi ngâm trong môi trường dạ dày của mẫu T và mẫu S là tương đối thấp. Mức độ giảm của mẫu S thấp hơn mức giảm của mẫu T cụ thể đối với mẫu S từ 0 – 120 phút độ giảm tế bào là 0.20 log CFU/g hạt còn mẫu T là 0.40 log CFU/g hạt. Trong khi đó mức độ giảm mật độ tế bào của mẫu hạt SN thì cao từ 0 – 120 phút độ giảm tế bào là 1.12 log CFU/ g hạt. Bên cạnh đó, mẫu ĐC thì mật độ tế bào sống sót giảm mạnh (3.81 log CFU/ g hạt) sau khi ngâm trong dịch dạ dày giả lập (p<0.05). Đối với mẫu S mức độ giảm mật độ tế bào diễn ra tương đối chậm hơn so với các mẫu khác, số tế bào bắt đầu giảm nhẹ sau khi ngâm 30 phút trong dịch dạ dày và giữ ổn định khi ngâm trong 90 phút, đến khi ngâm trong 120 phút thì mới tiếp tục giảm. So với nghiên cứu của R.R Mokarram (2009) thì khả năng sống sót sau khi ngâm hạt bao trong môi trường giả lập dạ dày trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn. Nguyên nhân có thể được giải thích là do mật độ tế bào S. boulardii ban đầu trong nghiên cứu của chúng tôi là không quá cao (7.46 – 7.54 log CFU/g hạt , còn trong nghiên cứu của R.R Mokarram thì mật độ tế bào ban đầu 9.36 – 9.56 log CFU/g hạt đối với L.acidophilus, 9.08 – 9.91 log CFU/g hạt đối với
L.rhamnosus) và kích thước hạt bao lớn (hạt từ 1.5 – 4mm ) so với hạt bao trong nghiên cứu R.R Mokarram (hạt bao một lớp: 47.543 ± 0.187 μm, hạt bao hai lớp: 75.339 ± 0.209 μm) vì thế mà cấu trúc của hạt ổn định, các tế bào được bao bọc hầu như hoàn toàn, số lượng tế bào bám trên bề mặt hạt bao ít nên khi ngâm hạt bao trong môi trường dạ dày thì lượng tế
32
bào sống sót không bị giảm nhiều. Như vậy, sau khi ngâm trong môi trường dịch dạ dày thì mẫu T có mật độ độ tế bào cao nhất, nhưng mẫu S có mức độ giảm mật độ tế bào thấp nhất.
33
Hình 3.4. Sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường giả lập dạ dày
ĐC: Mẫu đối chứng, mẫu không được bao gói (sinh khối thu được sau ly tâm) T: Mẫu hạt tươi sau khi bao gói S.boulardii
S: Mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii được khi sấy ở 400C trong 5 giờ
SN: Mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii được khi sấy ở 400C trong 5 giờ và nghiền.
0.40; 0.20; 3.81; 1.12 lần lượt là mức độ giảm mật độ tế bào của các mẫu T, S, ĐC, SN sau khi ngâm trong dịch ruột (120 phút)
Các chữ a,b,c,d cho biết mức độ khác biệt về mức độ giảm mật độ tế bào của các mẫu có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0.05). 3 4 5 6 7 8 0 3 0 6 0 9 0 1 2 0 ĐC T S SN 3.81a 0.40c 0.20d 1.12b Thời gian (phút) L o g C FU/g hạt
34
Hình 3.5 thể hiện sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường mô phỏng dịch ruột sau khi ngâm trong dịch dạ dày 60 phút. Kết quả cho thấy mật độ tế bào sống sót giảm khi tăng thời gian ngâm hạt bao gói trong môi trường dịch ruột. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của R.R Mokarram (2009) khi khảo sát L.acidophilus PTC1643 và
L.rhamnosus PTCC1637 được bao gói trong môi trường dịch ruột. Sau khi ngâm trong môi trường dạ dày (60 phút) mật độ tế bào đã giảm đáng kể (mẫu ĐC giảm 1.99 log CFU/ g hạt, 0.16 log CFU/ g hạt ở mẫu T, 0.10 log CFU/ g hạt ở mẫu S và 0.29 log CFU/ g hạt ở mẫu SN), tế bào S. boulardii tiếp tục đi qua môi trường muối mật tại đây mật độ tế bào có sự giảm. Một nghiên cứu của Prieto và cộng sự (2004) báo cáo rằng muối mật có thể gây hại cho các vi sinh vật là do chúng ngăn cản nhiều cơ chế bên trong tế bào bao gồm gây ra hiện tượng stress như quá trình sinh tổng hợp màng hay trong quá trình sửa chữa DNA của vi khuẩn [59]. Nhìn chung mức độ giảm mật độ tế bào của các mẫu hạt được bao gói là tương đối thấp và mẫu S có mức độ giảm mật độ tế bào thấp nhất, cụ thể là sau khi ngâm hạt bao gói trong môi trường dịch ruột (120 phút) thì mẫu S có số lượng tế bào giảm là 0.28 log CFU/g hạt, mẫu T là 0.48 log CFU/g hạt, mẫu SN là 1.27 lg CFU/g hạt. Trong khi đó ở mẫu ĐC thì mật độ tế bào sống sót giảm mạnh (3.97 log CFU/g hạt) sau khi ngâm trong môi trường dịch ruột (120 phút). So với nghiên cứu của R.R Mokarram (2009) khi khảo sát
L.acidophilus PTC1643 và L.rhamnosus PTCC1637 thì nghiên cứu của chúng tôi về S. boulardii được bao gói trong môi trường dịch ruột có số mức độ giảm mật độ tế bào thấp hơn. Nguyên nhân có thể là do kích thước hạt bao trong nghiên cứu của chúng tôi lớn (hạt từ 1.5 – 4mm ) so với hạt bao trong nghiên cứu của R.R Mokarram (hạt bao một lớp: 47.543 ± 0.187 μm, hạt bao hai lớp: 75.339 ± 0.209 μm), bên cạnh đó thì mật độ tế bào S. boulardii
ban đầu trong nghiên cứu của chúng tôi là không quá cao (7.46 – 7.54 log CFU/g hạt, còn trong nghiên cứu của R.R Mokarram thì mật độ tế bào ban đầu 9.66 – 9.87 log CFU/g hạt đối với L.acidophilus, 9.88 – 9.94 log CFU/g hạt đối với L.rhamnosus) vì thế mà số lượng tế bào bám trên bề mặt hạt bao ít, cấu trúc của hạt ổn định các tế bào được bao bọc hầu như hoàn toàn nên khi ngâm hạt bao trong môi trường dịch ruột thì lượng tế bào sống sót không bị giảm nhiều. Nghiên cứu của Ding và cộng sự (2007) chỉ ra rằng vi khuẩn probiotic được vi gói sống sót tốt hơn vi khuẩn tự do. Trong môi trường có bổ sung muối mật 3%, tế bào vi khuẩn tự do giảm 6.51 log (CFU/ml), trong khi chỉ giảm 3.36 log (CFU/ml) ở vi khuẩn được vi gói trong thời gian là 8 giờ. Sau 30 phút xử lý nhiệt độ 650C, tế bào vi khuẩn không được vi gói giảm 6.74 log (CFU/ml) trong khi tế bào được vi gói chỉ giảm 4.17 log
35
(CFU/ml) [23]. Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi là tương đồng với các nghiên cứu trước đây về khả năng sống sót của tế bào được bao gói trong môi trường dạ dày và dịch ruột cao hơn so với tế bào tự không được bao gói.
36
Hình 3.5. Sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường dịch ruột .
ĐC: Mẫu đối chứng, mẫu không được bao gói (sinh khối thu được sau ly tâm) T: Mẫu hạt tươi sau khi bao gói S.boulardii
S: Mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii được khi sấy ở 400C trong 5 giờ
SN: Mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii được khi sấy ở 400C trong 5 giờ và nghiền.
0.48; 0.28; 3.97; 1.27 lần lượt là mức độ giảm mật độ tế bào của các mẫu T, S, ĐC, SN sau khi ngâm trong dịch ruột (120 phút).
Các chữ a,b, c cho biết mức độ khác biệt về mức độ giảm mật độ tế bào của các mẫu có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0.05). 3 4 5 6 7 8 0 3 0 6 0 9 0 1 2 0 ĐC T S SN 3.97a 0.48c 0.28c 1.27b Thời gian (phút) L og C FU/ g hạt
37
3.5. Khảo sát mật độ tế bào theo thời gian lưu trữ của hạt bao gói
Sự thay đổi mật độ tế bào S.boulardii theo thời gian lưu trữ (0 – 12 ngày) được thể hiện ở Hình 3.6. Kết quả cho thấy mật độ tế bào giảm dần theo thời gian lưu trữ và mật độ tế bào sống sót giảm ở mẫu lưu trữ ở 50C thấp hơn so với mẫu lưu trữ ở nhiệt độ 300C, cụ thể là mẫu ĐC lưu trữ ở 50C thì mật độ tế bào giảm là 2.02 log CFU/g và mẫu lưu trữ ở 300C là 2.15 log CFU/g, mẫu T lưu trữ ở 50C giảm là 1.1 log CFU/g và mẫu lưu trữ ở 300C là 1.26 log CFU/g, mẫu S lưu trữ ở 50C thì mật độ tế bào giảm là 0.95 log CFU/g và mẫu lưu trữ ở 300C là 1.18 log CFU/g, mẫu SN lưu trữ ở 50C thì giảm 1.1 log CFU/g và mẫu lưu trữ ở 300C là 1.25 log CFU/g. Sự ổn định của các hạt bao bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ bảo quản và hoạt động của nước, và thường nhiệt độ bảo quản thấp dẫn đến sự ổn định tốt hơn [28]. Nghiên cứu Sohail (2012) trong kĩ thuật sấy phun L. acidophilus cho thấy khả năng sống sót của L. acidophilus cao (khoảng 70%) khi bảo quản ở nhiệt độ 40C trong 6 tháng (Sohail, 2012). Soto et al. (2011) đã nghiên cứu việc sử dụng các macro-capsules L. casei DSPV 318 T, các viên nang được bảo quản ở 18 và 40C và khả năng tồn tại của nó được ghi nhận cho 63 ngày, kết quả cho thấy các viên nang có khả năng tồn tại trong tủ lạnh lớn hơn so với các viên nang ở nhiệt độ phòng [38]. Sau 12 ngày lưu trữ thì mật độ tế bào sống sót ở mẫu ĐC