Thông qua các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước, chúng tôi nhận thấy rằng kỹ thuật bao gói sử dụng alginate riêng lẻ hoặc kết hợp với các chất bảo vệ khác nhau cũng như nghiên cứu quá trình sấy loại bỏ nước nhằm tiết kiệm chi phí vận chuyển, bảo quản mà vẫn giữ được hoạt tính probiotic đang là đề tài được nhiều sự quan tâm. Đề tài chúng tôi thực hiện cũng không nằm ngoài mục đích trên và đây cũng là nghiên cứu đầu tiên thực hiện việc khảo sát khả năng sống sót của tế bào S. boulardii được bao gói trong alginate (có bổ sung maltodextrin) kết hợp sấy đối lưu trong môi trường dịch dạ dày và dịch ruột.
21
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm thực hiện
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh và Hóa sinh Bộ môn Công nghệ hóa học và Thực phẩm, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại Học Sư Phạm Kĩ Thuật TP.HCM.
2.2. Vật liệu
Vi sinh vật: Nấm men S. boulardii (BiofloraTM, hãng Biocodex, Pháp).
Hóa chất: Natri – alginate (Xilong chemical, China), CaCl2 (Guangdong Guanghua, China), maltodextrin. Dung dịch đệm phosphate 0.1 M có pH 7.0 (gồm 8 g NaCl (Xilong chemical, China), 0.2 g KCl (Xilong chemical, China), 1.44 g Na2HPO4 (Xilong chemical, China), 0.24 g KH2PO4 (Xilong chemical, China)), môi trường Hansen (trong 100 ml môi trường chứa glucose (Xilong chemical, China), 10 g, pepton 1g, KH2PO4 0.3 g, MgSO4.7H2O (Xilong chemical, China) 0.2 g, chloramphenicol 40 ppm) dạng lỏng và dạng bán rắn (bổ sung thêm 2% Agar (Vietxoco. Việt Nam), nước muối sinh lý (NaCl 0.9%), môi trường giả lập dịch dạ dày (0.08M HCl (Xilong chemical, China), 0.2% NaCl, pH 1.5), dịch ruột (0.05 M KH2PO4, pH 7.25, 0.6% muối mật).
2.3. Phương pháp thực hiện
2.3.1. Bao gói S. boulardii với natri alginate có bổ sung maltodextrin
Hoạt hóa S.boulardii ở 300C trong 24 giờ trong 10 ml môi trường Hansen, tiếp đến chuyển toàn bộ sang bình có chứa 100 ml môi trường Hansen nuôi cấy cùng điều kiện. Quá trình nhân giống thực hiện trong điều kiện hiếu khí, sử dụng thiết bị khuấy từ với tốc độ 300 vòng/phút. Sau 12 giờ kết thúc quá trình nuôi cấy và thu sinh khối, 100 ml huyền phù được ly tâm một lần với tốc độ 4000 rpm trong 10 phút, sau đó được rửa với 100 ml nước muối sinh lý (0.9% NaCl, 40C) trộn đều cặn và ly tâm lần 2 theo điều kiện như trên. Tế bào S. boulardii được rửa 2 lần, lần đầu với nước muối sinh lý, lần sau với nước cất vô trùng, sau đó thu sinh khối và chuẩn bị cho quá trình vi bao. Chất bao là dung dịch alginate 2% (w/v) có bổ sung 1.00% (w/v) maltodextrin (HiMedia, India). Dung dịch alginate được ngâm 24 giờ để alginate được hòa tan hoàn toàn, sau đó tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút trước khi dùng. Maltodextrin được hòa tan với nước cất rồi bổ sung vào dung dịch alginate ở điều kiện thường. Cho sinh khối thu được sau ly tâm được vào 200 ml dung dịch alginate 2% (w/v) có
22
bổ sung maltodextrin 1.00% (w/v), khuấy điều hỗn hợp bằng máy khuấy từ với tốc độ 300 vòng/ phút, thực hiện ở 40C trong 15 phút để các thành phần được hòa tan vào nhau hoàn toàn. Quá trình bao gói được thực hiện bằng cách dùng bơm kim tiêm nhỏ giọt hỗn hợp trên vào dung dịch CaCl2 0.75% đặt trên mấy khuấy từ để các hạt không dính vào nhau. Tỷ lệ hỗn hợp alginate và S.boulardii với dung dịch CaCl2 là 1 : 5. Các thao tác với S.boulardii
thực hiện ở điều kiện 40C. Sau khi kết thúc quá trình nhỏ giọt, dung dịch CaCl2 chứa hạt bao gói được giữ ở 40C trong 30 phút để hạt bao ổn định cấu trúc. Sau đó tiến hành lọc hạt qua rây, rửa với 200 ml nước muối sinh lý và 200 ml nước cất, làm ráo lúc này thu được mẫu hạt tươi (T). Tiếp theo, cho mẫu T vào tủ sấy đối lưu trong 5 giờ ở 400C, thu được mẫu hạt sấy (S). Một phần mẫu T được đem đi nghiền mịn, lúc này thu được mẫu hạt sấy nghiền (SN) để tiến hành khảo sát. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô trùng [71].
2.3.2. Khảo sát đường cong sinh trưởng của S. boulardii
Nhân giống cấp 1 bằng cách chuyển giống từ ống thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 10 ml môi trường Hansen lỏng, ủ 48 giờ ở 300C. Nhân giống cấp 2 bằng cách chuyển giống từ ống nghiệm cấp 1 sang bình cầu 100 ml trong điều kiện 300C có khuấy lắc. Sau mỗi giờ lấy mẫu trải đĩa kiểm tra mật độ tế bào 1 lần. Khảo sát và dựng đường cong sinh trưởng.
2.3.3. Khảo sát cấu trúc tinh thể của hạt bao alginate sau khi sấy
Chuẩn bị 3 hỗn hợp : mẫu chỉ chứa 2% alginate (a); mẫu có chứa 2% alginate và 1% maltodextrin (b); mẫu có chứa 2% alginate, 1% maltodextrin và 100 ml sinh khối S. boulardii
thu được sau ly tâm (c). Tiến hành dùng bơm kim tiêm nhỏ giọt hỗn hợp X (a, b hoặc c) vào dung dịch CaCl2 0.75% đặt trên máy khuấy từ. Tỷ lệ hỗn hợp X với dung dịch CaCl2 là 1:5. Sau khi kết thúc quá trình nhỏ giọt dung dịch CaCl2 chứa hạt bao gói được giữ ở 40C trong 30 phút để hạt bao ổn định cấu trúc. Sau đó tiến hành lọc hạt qua rây, rửa với 200 ml nước muối sinh lý và 200 ml nước cất, làm ráo rồi cho hạt vào tủ sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ thu được hạt bao sau sấy [71]. Khi X tương ứng với a thì thu được mẫu hạt bao sau khi sấy chỉ chứa alginate (A); X tương ứng với b thì lúc này thu được mẫu hạt bao sau khi sấy chứa alginate có bổ sung maltodextrin (B); X tương ứng với c thì thu được mẫu hạt bao sau khi sấy chứa alginate có bổ sung maltodextrin và S.boulardii (C). Cấu trúc tinh thể của hạt bao alginate sau khi sấy được thể hiện qua mô hình nhiễu xạ tia X (Miniflex gonio Meter, Nhật Bản), tiếp xúc với bức xạ Cu (30kv × 15 mA), phạm vi quét từ 10 đến 900 (2θ) [66].
23
2.3.4. Đánh giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trường giả lập dịch dạ dày và dịch ruột. dày và dịch ruột.
a. Khảo sát trong môi trường giả lập dịch dạ dày
Cho 1 g hạt vi gói vào 10 ml môi trường giả lập dạ dày vô trùng (0.08M HCl, 0.2% NaCl, pH 1.5) không có pepsin và ủ ở 370C đến 120 phút. Sau khi ủ các hạt ở các khoảng thời gian khác nhau tiến hành rửa bằng dung dịch peptone 0.1% (10 ml). Tiến hành trãi đĩa đếm tế bào (cho 1 g hạt vi gói vào 9 ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M có pH 7.0 lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút, tiến hành trãi đĩa) Thực hiện 3 lần lặp lại. Theo dõi mật độ vi khuẩn S. boulardii tại các thời điểm [52].
b. Khảo sát trong môi trường mô phỏng dịch ruột
Tiến hành thí nghiệm: 1 g hạt vi gói ngâm trong 10 ml dung dịch axit trong dạ dày mô phỏng (0.08 M HCl, 0.2% NaCl, pH 1.5) mà không pepsin và ủ 370C trong 60 phút. Sau khi ủ, lấy ra trung hòa bằng NaOH sao đó cho vào 9 ml nước vô trùng đường ruột mô phỏng (0.05M KH2PO4, pH 7.25, 0.6% muối mật) rồi đem ủ ở 370C đến 120 phút. Tiến hành trãi đĩa đếm tế bào (cho 1 g vi gói vào 9 ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M có pH 7.0 lắc nhẹ nhàng ở nhiệt độ phòng trong 60 phút, tiến hành trãi đĩa) Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi mật độ vi khuẩn S.boulardii tại các thời điểm [52].
2.3.5. Khảo sát mật độ tế bào theo thời gian lưu trữ của hạt bao gói
Tiến hành thí nghiệm: Lưu trữ các mẫu gồm: mẫu đối chứng (ĐC) là sinh khối thu được sau ly tâm; hạt bao tươi (T) ; hạt bao đã sấy đối lưu ở 400C, trong 5 giờ (S); hạt bao đã sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ và nghiền (SN). Tiến hành khảo sát các mẫu ở hai khoảng nhiệt độ lưu trữ là 50C, 300C và theo dõi mật độ tế bào đến 12 ngày.
2.3.6. Khảo sát khả năng tồn tại của S. boularddi trong môi trường giả lập dạ dày và dịch mật sau khi 12 ngày lưu trữ. và dịch mật sau khi 12 ngày lưu trữ.
Cách tiến hành: sau 12 ngày lưu trữ các mẫu (mẫu đối chứng (ĐC) là sinh khối thu được sau ly tâm; hạt bao tươi (T); hạt bao đã sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ (S); hạt bao đã sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ nghiền (SN)) ở hai khoảng nhiệt độ 50C và 300C, tiến hành
24
thí nghiệm khảo sát trong môi trường dịch dạ dày và dịch ruột (như mục 2.3.4 ) ở mốc thời gian 120 phút.
2.3.7. Phương pháp phân tích thu nhận kết quả
a. Phương pháp phân tích hóa sinh
Xác định pH dung dịch đệm bằng máy đo pH Eutech instruments pH 510, xác định độ ẩm bằng tủ sấy đối lưu.
Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đối lưu đến khối lượng không đổi, sử dụng thiết bị sấy đối lưu.Công thức xác định độ ẩm:
% Độ ẩm = 100 w w w f i i
Trong đó: wf, wi lần lượt là khối lượng của nguyên liệu trước và sau quá trình sấy (AOAC, 1984).
b. Phương pháp phân tích vi sinh
Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc trên đĩa petri bằng kỹ thuật trải đĩa trên môi trường Hansen.
Mật độ tế bào = 𝑁
𝑛1.𝑓1.𝑉+𝑛2.𝑓2.𝑉+⋯+𝑛𝑛.𝑓𝑛.𝑉
Trong đó: N là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa (chỉ lấy các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 và nồng độ pha loãng là liên tiếp nhau). n là số đĩa ở nồng độ pha loãng f. V là thể tích mẫu đưa vào đĩa (ml) [29].
Chúng tôi tiến hành bao gói 50 ml huyền phù nấm men. Sau quá trình bao gói thu được 38.22 ± 0.09 g hạt tươi, sau khi sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ thu được 2.45 ± 0.04 g hạt khô. Qui về g hạt tươi sẽ được:
1 g hạt = 1 g hạt tươi (T) = 0.0641 g hạt sấy (S) = 0.0641 g hạt sấy nghiền (SN) = 1.31 ml huyền phù nấm men (ĐC).
c. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, thực hiện hoàn toàn ngẫu nhiên. Kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê IBM SPSS Statistics 20, phần mềm Excel versions 2013.
25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đường cong sinh trưởng của S. boulardii
Từ Hình 3.1. cho thấy, mật độ tế bào S.boulardii tăng liên tục và đạt cực đại (8.70 log cfu/ml) vào giờ thứ 12 của quá trình nuôi cấy sau đó mật độ tế bào có xu hướng giảm dần, S.boulardii bắt đầu bước vào pha ổn định rồi pha suy vong. Với hàm lượng đường 10%, đường cong sinh trưởng của S. boulardii có đặc điểm pha thích nghi kéo dài 2 giờ, pha sinh trưởng kéo dài 12h (Hình 3.1), vì vậy thời điểm thu nhận sinh khối thích hợp là vào giờ thứ 12.
26
Hình 3.1. Đường cong sinh trưởng S. boulardii
Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn 7.0 7.4 7.8 8.2 8.6 9.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 L o g CF U/m l
27
3.2. Đặc điểm hạt vi bao S. boulardii
3.2.1. Hình dạng hạt vi bao sau khi vi bao
Hạt vi bao: tròn hoặc elip màu trắng đục, mềm do hàm lượng nước cao, kích thước hạt từ 2.5 – 3.0 mm (Hình 3.2. A.). Áp dụng phương pháp nhỏ giọ, R. Vidhyalakshmi cho rằng đường kính hạt vi bao khoảng 2000 µm [74]. Parthiban Muthukumarasamy đã vi bao
Lactobacillus reuteri bằng alginate theo phương pháp nhỏ giọt. Kết quả hạt vi bao có đường kính 2-3 mm [57]. Như vậy so với những nghiên cứu trước đó, đường kính hạt vi bao trong nghiên cứu của chúng tôi to hơn. Điều này có thể do kích thước đầu mũi ống tiêm của chúng tôi lớn hơn và tế bào nấm men có kích thước lớn hơn tế bào lactic. Đồng thời khoảng cách từ ống tiêm xuống dung dịch alginate và tốc độ khuấy khi nhỏ giọt cũng gây ảnh hưởng đến kích thước tế bào.
3.2.2. Hình dạng hạt sau khi sấy
Hạt sau khi sấy: có màu vàng nâu, đường kính khoảng 0.5 – 1.5 mm, độ cứng tăng so với hạt vi bao ban đầu (Hình 3.2. B). Chúng tôi cho rằng hạt chuyển sang màu vàng nâu có thể do trong thành phần màng tế bào nấm men có chứa lipid, do đó trong quá trình sấy đối lưu có thể xảy ra phản ứng peroxyde hóa làm biến đổi màu của hạt sau khi sấy. Hạt vi bao sau khi sấy bị biến dạng do chịu ảnh hưởng của nhiệt độ trong thời gian khá dài và trong quá trình sấy chúng tôi tiến hành đảo hạt 30 phút/1 lần để sấy đều các mặt.
28
A. Trước khi sấy B. Sau khi sấy
29
3.3. Đánh giá mật độ kết tinh của hạt bao gói sau khi sấy
Sự kết tinh của hạt bao gói sau khi sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ được thể hiện ở
Hình 3.3. Sự hiện diện của các đỉnh cho thấy hạt bao có bổ sung thêm các thành phần khác (bổ sung maltodextrin và S.boulardii) vẫn còn giữ được trạng thái tinh thể so với mẫu A. Kết quả cho thấy sau khi sấy thì cấu trúc mẫu C gần như không có sự thay đổi so với mẫu B, mặc dù trong 3 mẫu hạt có xuất hiện những đỉnh nhỏ ở những góc khác nhau trên từng mẫu hạt, nhưng nhìn chung đỉnh nhọn đặc trưng cho cấu trúc tinh thể alginate không có sự khác biệt. Trong nghiên cứu của Liangbin Li (2007), gel calcium alginate cho cấu trúc tinh thể với 22.90 là đỉnh chính [39]. Kết quả cho chụp nhiễu xạ tia X của các mẫu hạt bao alginate của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của Liangbin Li. Như vậy khi bổ sung S. boulardii
và maltodextrin vào alginate thì không làm ảnh hưởng đến trạng thái kết tinh của hạt gel, chính vì thế mà mạng tinh thể của hạt bao được ổn định cấu trúc, tế bào S. boulardii được bao bọc, bảo vệ tốt làm tăng khả năng chống chịu của S. boulardii trong các điều kiện khắc nghiệt như trong môi trường dạ dày, muối mật.
30
Hình 3.3. Nhiễu xạ tia X của các mẫu hạt bao sau khi sấy
A: Mẫu hạt chỉ chứa natri alginate sau khi sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ
B: Mẫu hạt chứa natri alginate có bổ sung maltodextrin sau khi sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ C: Mẫu hạt chứa natri alginate có bổ sung maltodextrin và S. boilardii sau khi sấy đối lưu ở 400C trong 5 giờ 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 C ườn g độ tươn g đố i 2ϴ A B C
31
3.4. Đánh giá khả năng sống sót của S. boulardii trong môi trường giả lập dịch dạ dày và dịch ruột. và dịch ruột.
Sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường giả lập dạ dày được thể hiện ở Hình 3.4. Kết quả cho thấy mật độ tế bào sống sót tỉ lệ nghịch với thời gian ngâm hạt bao gói trong môi trường giả lập dạ dày. Kết quả tương đồng với nghiên cứu của R.R Mokarram (2009) khi khảo sát L.acidophilus PTC1643 và L.rhamnosus PTCC1637 được bao gói trong môi trường giả lập dạ dày. Tại thời điểm 0 giờ mật độ tế bào của mẫu ĐC và mẫu T là không có sự khác biệt cụ thể là ở mẫu ĐC mật độ tế bào là 7.50 ± 0.03 log CFU/g hạt và mẫu T là 7.46 ± 0.05 log CFU/g hạt , trong khi đó so với mẫu ĐC thì mật độ tế bào ở mẫu S và SN có sự khác biệt đáng kể (mẫu S có mật độ tế bào là 6.57 ± 0.03 log CFU/g hạt, mẫu SN là 4.61 ± 0.02 log CFU/g hạt). Chúng tôi cho rằng quá trình bao gói thực hiện ở điều kiện nhiệt độ 40C ít làm ảnh hưởng đến tế bào nên mật độ tế bào giữa mẫu ĐC và T không có sự khác biệt, tuy nhiên đối với mẫu S và SN thì sau quá trình sấy, do bị sốc nhiệt và mất nước nên mật độ tế bào giảm, thêm vào đó dưới tác động của lực cơ học trong quá trình nghiền hạt làm cho mật độ tế bào ở mẫu SN thấp. Nhìn chung mức độ giảm mật độ tế bào sau khi ngâm trong môi trường dạ dày của mẫu T và mẫu S là tương đối thấp. Mức độ giảm của mẫu S thấp hơn mức giảm của mẫu T cụ thể đối với mẫu S từ 0 – 120 phút độ giảm tế bào là 0.20 log CFU/g hạt còn mẫu T là 0.40 log CFU/g hạt. Trong khi đó mức độ giảm mật độ tế bào của mẫu hạt SN thì cao từ 0 – 120 phút độ giảm tế bào là 1.12 log CFU/ g hạt. Bên cạnh đó, mẫu ĐC thì mật độ tế bào sống sót giảm mạnh (3.81 log CFU/ g hạt) sau khi ngâm trong dịch dạ dày giả lập (p<0.05). Đối với mẫu S mức độ giảm mật độ tế bào diễn ra tương đối chậm hơn so với các mẫu khác, số tế bào bắt đầu giảm nhẹ sau khi ngâm 30 phút trong dịch dạ dày và giữ ổn