và dịch ruột.
Sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường giả lập dạ dày được thể hiện ở Hình 3.4. Kết quả cho thấy mật độ tế bào sống sót tỉ lệ nghịch với thời gian ngâm hạt bao gói trong môi trường giả lập dạ dày. Kết quả tương đồng với nghiên cứu của R.R Mokarram (2009) khi khảo sát L.acidophilus PTC1643 và L.rhamnosus PTCC1637 được bao gói trong môi trường giả lập dạ dày. Tại thời điểm 0 giờ mật độ tế bào của mẫu ĐC và mẫu T là không có sự khác biệt cụ thể là ở mẫu ĐC mật độ tế bào là 7.50 ± 0.03 log CFU/g hạt và mẫu T là 7.46 ± 0.05 log CFU/g hạt , trong khi đó so với mẫu ĐC thì mật độ tế bào ở mẫu S và SN có sự khác biệt đáng kể (mẫu S có mật độ tế bào là 6.57 ± 0.03 log CFU/g hạt, mẫu SN là 4.61 ± 0.02 log CFU/g hạt). Chúng tôi cho rằng quá trình bao gói thực hiện ở điều kiện nhiệt độ 40C ít làm ảnh hưởng đến tế bào nên mật độ tế bào giữa mẫu ĐC và T không có sự khác biệt, tuy nhiên đối với mẫu S và SN thì sau quá trình sấy, do bị sốc nhiệt và mất nước nên mật độ tế bào giảm, thêm vào đó dưới tác động của lực cơ học trong quá trình nghiền hạt làm cho mật độ tế bào ở mẫu SN thấp. Nhìn chung mức độ giảm mật độ tế bào sau khi ngâm trong môi trường dạ dày của mẫu T và mẫu S là tương đối thấp. Mức độ giảm của mẫu S thấp hơn mức giảm của mẫu T cụ thể đối với mẫu S từ 0 – 120 phút độ giảm tế bào là 0.20 log CFU/g hạt còn mẫu T là 0.40 log CFU/g hạt. Trong khi đó mức độ giảm mật độ tế bào của mẫu hạt SN thì cao từ 0 – 120 phút độ giảm tế bào là 1.12 log CFU/ g hạt. Bên cạnh đó, mẫu ĐC thì mật độ tế bào sống sót giảm mạnh (3.81 log CFU/ g hạt) sau khi ngâm trong dịch dạ dày giả lập (p<0.05). Đối với mẫu S mức độ giảm mật độ tế bào diễn ra tương đối chậm hơn so với các mẫu khác, số tế bào bắt đầu giảm nhẹ sau khi ngâm 30 phút trong dịch dạ dày và giữ ổn định khi ngâm trong 90 phút, đến khi ngâm trong 120 phút thì mới tiếp tục giảm. So với nghiên cứu của R.R Mokarram (2009) thì khả năng sống sót sau khi ngâm hạt bao trong môi trường giả lập dạ dày trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn. Nguyên nhân có thể được giải thích là do mật độ tế bào S. boulardii ban đầu trong nghiên cứu của chúng tôi là không quá cao (7.46 – 7.54 log CFU/g hạt , còn trong nghiên cứu của R.R Mokarram thì mật độ tế bào ban đầu 9.36 – 9.56 log CFU/g hạt đối với L.acidophilus, 9.08 – 9.91 log CFU/g hạt đối với
L.rhamnosus) và kích thước hạt bao lớn (hạt từ 1.5 – 4mm ) so với hạt bao trong nghiên cứu R.R Mokarram (hạt bao một lớp: 47.543 ± 0.187 μm, hạt bao hai lớp: 75.339 ± 0.209 μm) vì thế mà cấu trúc của hạt ổn định, các tế bào được bao bọc hầu như hoàn toàn, số lượng tế bào bám trên bề mặt hạt bao ít nên khi ngâm hạt bao trong môi trường dạ dày thì lượng tế
32
bào sống sót không bị giảm nhiều. Như vậy, sau khi ngâm trong môi trường dịch dạ dày thì mẫu T có mật độ độ tế bào cao nhất, nhưng mẫu S có mức độ giảm mật độ tế bào thấp nhất.
33
Hình 3.4. Sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường giả lập dạ dày
ĐC: Mẫu đối chứng, mẫu không được bao gói (sinh khối thu được sau ly tâm) T: Mẫu hạt tươi sau khi bao gói S.boulardii
S: Mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii được khi sấy ở 400C trong 5 giờ
SN: Mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii được khi sấy ở 400C trong 5 giờ và nghiền.
0.40; 0.20; 3.81; 1.12 lần lượt là mức độ giảm mật độ tế bào của các mẫu T, S, ĐC, SN sau khi ngâm trong dịch ruột (120 phút)
Các chữ a,b,c,d cho biết mức độ khác biệt về mức độ giảm mật độ tế bào của các mẫu có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0.05). 3 4 5 6 7 8 0 3 0 6 0 9 0 1 2 0 ĐC T S SN 3.81a 0.40c 0.20d 1.12b Thời gian (phút) L o g C FU/g hạt
34
Hình 3.5 thể hiện sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường mô phỏng dịch ruột sau khi ngâm trong dịch dạ dày 60 phút. Kết quả cho thấy mật độ tế bào sống sót giảm khi tăng thời gian ngâm hạt bao gói trong môi trường dịch ruột. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của R.R Mokarram (2009) khi khảo sát L.acidophilus PTC1643 và
L.rhamnosus PTCC1637 được bao gói trong môi trường dịch ruột. Sau khi ngâm trong môi trường dạ dày (60 phút) mật độ tế bào đã giảm đáng kể (mẫu ĐC giảm 1.99 log CFU/ g hạt, 0.16 log CFU/ g hạt ở mẫu T, 0.10 log CFU/ g hạt ở mẫu S và 0.29 log CFU/ g hạt ở mẫu SN), tế bào S. boulardii tiếp tục đi qua môi trường muối mật tại đây mật độ tế bào có sự giảm. Một nghiên cứu của Prieto và cộng sự (2004) báo cáo rằng muối mật có thể gây hại cho các vi sinh vật là do chúng ngăn cản nhiều cơ chế bên trong tế bào bao gồm gây ra hiện tượng stress như quá trình sinh tổng hợp màng hay trong quá trình sửa chữa DNA của vi khuẩn [59]. Nhìn chung mức độ giảm mật độ tế bào của các mẫu hạt được bao gói là tương đối thấp và mẫu S có mức độ giảm mật độ tế bào thấp nhất, cụ thể là sau khi ngâm hạt bao gói trong môi trường dịch ruột (120 phút) thì mẫu S có số lượng tế bào giảm là 0.28 log CFU/g hạt, mẫu T là 0.48 log CFU/g hạt, mẫu SN là 1.27 lg CFU/g hạt. Trong khi đó ở mẫu ĐC thì mật độ tế bào sống sót giảm mạnh (3.97 log CFU/g hạt) sau khi ngâm trong môi trường dịch ruột (120 phút). So với nghiên cứu của R.R Mokarram (2009) khi khảo sát
L.acidophilus PTC1643 và L.rhamnosus PTCC1637 thì nghiên cứu của chúng tôi về S. boulardii được bao gói trong môi trường dịch ruột có số mức độ giảm mật độ tế bào thấp hơn. Nguyên nhân có thể là do kích thước hạt bao trong nghiên cứu của chúng tôi lớn (hạt từ 1.5 – 4mm ) so với hạt bao trong nghiên cứu của R.R Mokarram (hạt bao một lớp: 47.543 ± 0.187 μm, hạt bao hai lớp: 75.339 ± 0.209 μm), bên cạnh đó thì mật độ tế bào S. boulardii
ban đầu trong nghiên cứu của chúng tôi là không quá cao (7.46 – 7.54 log CFU/g hạt, còn trong nghiên cứu của R.R Mokarram thì mật độ tế bào ban đầu 9.66 – 9.87 log CFU/g hạt đối với L.acidophilus, 9.88 – 9.94 log CFU/g hạt đối với L.rhamnosus) vì thế mà số lượng tế bào bám trên bề mặt hạt bao ít, cấu trúc của hạt ổn định các tế bào được bao bọc hầu như hoàn toàn nên khi ngâm hạt bao trong môi trường dịch ruột thì lượng tế bào sống sót không bị giảm nhiều. Nghiên cứu của Ding và cộng sự (2007) chỉ ra rằng vi khuẩn probiotic được vi gói sống sót tốt hơn vi khuẩn tự do. Trong môi trường có bổ sung muối mật 3%, tế bào vi khuẩn tự do giảm 6.51 log (CFU/ml), trong khi chỉ giảm 3.36 log (CFU/ml) ở vi khuẩn được vi gói trong thời gian là 8 giờ. Sau 30 phút xử lý nhiệt độ 650C, tế bào vi khuẩn không được vi gói giảm 6.74 log (CFU/ml) trong khi tế bào được vi gói chỉ giảm 4.17 log
35
(CFU/ml) [23]. Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi là tương đồng với các nghiên cứu trước đây về khả năng sống sót của tế bào được bao gói trong môi trường dạ dày và dịch ruột cao hơn so với tế bào tự không được bao gói.
36
Hình 3.5. Sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường dịch ruột .
ĐC: Mẫu đối chứng, mẫu không được bao gói (sinh khối thu được sau ly tâm) T: Mẫu hạt tươi sau khi bao gói S.boulardii
S: Mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii được khi sấy ở 400C trong 5 giờ
SN: Mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii được khi sấy ở 400C trong 5 giờ và nghiền.
0.48; 0.28; 3.97; 1.27 lần lượt là mức độ giảm mật độ tế bào của các mẫu T, S, ĐC, SN sau khi ngâm trong dịch ruột (120 phút).
Các chữ a,b, c cho biết mức độ khác biệt về mức độ giảm mật độ tế bào của các mẫu có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0.05). 3 4 5 6 7 8 0 3 0 6 0 9 0 1 2 0 ĐC T S SN 3.97a 0.48c 0.28c 1.27b Thời gian (phút) L og C FU/ g hạt
37
3.5. Khảo sát mật độ tế bào theo thời gian lưu trữ của hạt bao gói
Sự thay đổi mật độ tế bào S.boulardii theo thời gian lưu trữ (0 – 12 ngày) được thể hiện ở Hình 3.6. Kết quả cho thấy mật độ tế bào giảm dần theo thời gian lưu trữ và mật độ tế bào sống sót giảm ở mẫu lưu trữ ở 50C thấp hơn so với mẫu lưu trữ ở nhiệt độ 300C, cụ thể là mẫu ĐC lưu trữ ở 50C thì mật độ tế bào giảm là 2.02 log CFU/g và mẫu lưu trữ ở 300C là 2.15 log CFU/g, mẫu T lưu trữ ở 50C giảm là 1.1 log CFU/g và mẫu lưu trữ ở 300C là 1.26 log CFU/g, mẫu S lưu trữ ở 50C thì mật độ tế bào giảm là 0.95 log CFU/g và mẫu lưu trữ ở 300C là 1.18 log CFU/g, mẫu SN lưu trữ ở 50C thì giảm 1.1 log CFU/g và mẫu lưu trữ ở 300C là 1.25 log CFU/g. Sự ổn định của các hạt bao bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ bảo quản và hoạt động của nước, và thường nhiệt độ bảo quản thấp dẫn đến sự ổn định tốt hơn [28]. Nghiên cứu Sohail (2012) trong kĩ thuật sấy phun L. acidophilus cho thấy khả năng sống sót của L. acidophilus cao (khoảng 70%) khi bảo quản ở nhiệt độ 40C trong 6 tháng (Sohail, 2012). Soto et al. (2011) đã nghiên cứu việc sử dụng các macro-capsules L. casei DSPV 318 T, các viên nang được bảo quản ở 18 và 40C và khả năng tồn tại của nó được ghi nhận cho 63 ngày, kết quả cho thấy các viên nang có khả năng tồn tại trong tủ lạnh lớn hơn so với các viên nang ở nhiệt độ phòng [38]. Sau 12 ngày lưu trữ thì mật độ tế bào sống sót ở mẫu ĐC giảm đáng kể theo mỗi thời điểm khảo sát còn các mẫu còn lại thì mức độ giảm mật độ tế bào thấp hơn và mẫu S có mật độ tế bào sống sót giảm ít nhất trong cả hai điều kiện nhiệt độ lưu trữ 50C và 300C. Ở mẫu T, mật độ tế bào giảm chậm từ ngày thứ 0 đến ngày thứ 9 và bắt đầu từ ngày 9 trở đi thì giảm nhanh (cụ thể là ở điều kiện lưu trữ 50C thì trong các khoảng thời gian từ ngày 0 – 9 thì độ giảm mật độ tế bào là trong khoảng 0.2 – 0.29 log CFU/g, từ ngày 9 – 12 thì độ giảm là 0.36 log CFU/g và 0.41 log CFU/g khi lưu trữ ở 300C. Chúng tôi cho rằng khi thời gian lưu trữ càng tăng thì cấu trúc gel giữa maltodextrin và alginate bắt đầu trở nên lỏng lẻo (dấu hiệu nhận thấy là sau từng ngày lưu trữ lượng nước thoát ra hạt bao càng tăng và sau 30 phút ngâm hạt bao gói trong dung dịch đệm photphat thì hạt bao gói gần như đã phân rã hoàn toàn) làm giảm khả năng bao bọc và bảo vệ tế bào bên trong. Đối với mẫu S ở cả hai điều kiện nhiệt độ lưu trữ thì mật độ tế bào giảm nhanh sau khi sấy đến ngày thứ 3 và sau đó chậm lại (trong khoảng thời gian từ ngày 0 – 3 thì độ giảm mật độ tế bào là 0.33 log CFU/g (lưu trữ ở 50C) và 0.42 log CFU/g (lưu trữ ở 300C), còn trong các khoảng thời gian từ ngày 3 – 12 thì độ giảm mật độ tế bào là trong khoảng 0.2 – 0.22 log CFU/g (lưu trữ ở 50C), 0.24 – 0.27 log CFU/g (lưu trữ ở 300C). Chúng tôi cho rằng sau quá trình sấy tế bào bị tổn thương bởi nhiệt và mất nước nên số lượng tế bào giảm đáng kể nhưng
38
sau khi giảm đến một mức nào đó thì số lượng tế bào hầu như ít thay đổi vì các tế bào đã dần chịu được điều kiện khắc nghiệt và sẽ vẫn còn sống sót sau một thời gian. Tương tự như với mẫu S thì mẫu SN có mật độ tế bào giảm nhanh từ ngày 0 – 3 và sau đó chậm lại, nhưng mật độ tế bào giảm nhiều hơn so với mẫu S. Điều này cũng giống như mẫu S là mẫu SN cũng bị tổn thương do nhiệt, mất nước và bên cạnh đó thì còn chịu một phần lực tác động cơ học của quá trình nghiền hạt nên số lượng tế bào giảm đến một mức độ nào đó và sau đó ít thay đổi do các tế bào đã chịu được điều kiện khắc nghiệt, nhưng do kích thước hạt nhỏ ảnh hưởng đến hiệu quả bao chính vì thế mà sau khi giảm nhanh từ ngày 0 – 3 (giảm 0.38 log CFU/g (lưu trữ ở 50C), 0.45 log CFU/g (lưu trữ ở 300C), thì mật độ tế bào bào bắt đầu giảm chậm lại và tiếp tục giảm nhanh dần theo thời gian. Như vậy, khi được lưu trữ ở nhiệt dộ 50C tế bào S.boulardii có khả năng sống sót cao hơn ở 300C và mẫu S có mức độ giảm mật độ tế bào thấp nhất trong các mẫu hạt bao khi lưu trữ 12 ngày ở cả hai điều kiện nhiệt độ lưu trữ.
39
Hình 3.6. Sự thay đổi mật độ tế bào S.boulardii theo thời gian lưu trữ
A: Lưu trữ ở nhiệt độ 50C B: Lưu trữ ở nhiệt độ 300C
ĐC: Mẫu đối chứng, mẫu không được bao gói (sinh khối thu được sau ly tâm) T: Mẫu hạt tươi sau khi bao gói S.boulardii
S: Mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii được khi sấy ở 400C trong 5 giờ
SN: Mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii được khi sấy ở 400C trong 5 giờ và nghiền. ∆: Mức độ giảm mật độ tế bào sau 12 ngày lưu trữ (log CFU/g)
Các chữ a, b, c cho biết mức độ khác biệt về ∆ của các mẫu có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0.05).
3 4 5 6 7 8 ∆ = 2.02a ∆ = 1.10b ∆ = 0.95b ∆ = 1.10b A L o g C FU/g hạt 3 4 5 6 7 8 0 3 6 9 1 2 ĐC T S SN ∆ = 2.15a ∆ = 1.26b ∆ = 1.18b ∆ = 1.24b B
Thời gian (ngày)
L og C FU/g h ạt
40